李新芝，張治平，司軍強，張忠雙，李 靜，石文艷，馬克濤△

(1.石河子大學醫(yī)學院新疆地方與民族高發(fā)病省部共建重點實驗室-電生理研究室，2.第一附屬醫(yī)院耳鼻喉科，石河子 832002)

血管微動脈病變主要導致血管的舒縮功能障礙，而微動脈細胞靜息膜電位(resting membrane potential，RP)在血管舒縮調節(jié)中發(fā)揮重要的作用。研究發(fā)現(xiàn)，管腔壓力為零的離體微動脈細胞RP在-60～-75 mV之間[1]。管腔壓力為60mmHg或在體[2]情況下微動脈細胞RP為-40mV。不同部位微動脈間的差異較大，有報道稱遠端大腦微動脈的靜息膜電位要遠高于近端大腦微動脈[3]。此外我們前期在離體豚鼠耳蝸螺旋動脈上發(fā)現(xiàn)細胞RP呈獨特的雙峰分布，52%細胞RP平均在-74 mV，48%細胞RP平均在-41 mV，高K+和神經(jīng)遞質ACh在高、低RP細胞上的反應形式和離子機制都截然不同[4，5]。本研究是以急性分離的豚鼠冠狀動脈微動脈(coronary arteriole，CA)為研究對象，應用細胞內微電極技術記錄微動脈細胞RP，分析維持RP的離子機制，為我們更好的了解CA細胞的電生理特性提供實驗和理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及標本制備

實驗所用豚鼠雌雄不拘(新疆自治區(qū)疾病控制中心動物飼養(yǎng)科提供，動物質量符合一級標準)，重約250～500g。肌注的混合麻醉藥物是氯胺酮500mg、甲苯噻嗪20mg和乙酰丙嗪10mg溶于8.5 ml蒸餾水中，配制成混合麻醉藥物，按1 ml/kg臀部肌肉注射，動物在麻醉狀態(tài)下放血處死，迅速取出心臟，并置于含有95%O2和5%CO2的 37℃飽和生理鹽溶液(Krebs)中。Krebs液成分是(mmol/L):NaCl 125 ，KCl 5 ，CaCl21.6 ，MgCl21.2 ，NaH2PO41.2 ，NaHCO320，葡萄糖 8.3，將pH 調至 7.4。在Krebs液中，迅速取出冠狀動脈相連的輻射狀微小動脈，置于Krebs液中孵育30min后進行實驗。

1.2 細胞內微電極記錄

孵育后的標本轉移到記錄用實驗灌流槽中，血管段長約2～5 mm，直徑約為40～80μm。在顯微鏡下清除與CA相連的結締組織，再用很細小的鋼針將CA固定在灌流槽底部的硅膠上。連續(xù)用37℃的生理鹽溶液灌流30min之后可持續(xù)進行電生理實驗6～8 h。微電極內充灌2 mol/L KCl，阻抗為 60～150MΩ。細胞內穿刺是通過微操縱推進器推動玻璃微電極刺向血管外表面進行盲插，同時通過NPI前置放大器監(jiān)測跨膜電位和注射電流，生物電信號通過PC計算機記錄。采樣間隔為0.1、0.5或10ms。成功刺入細胞穩(wěn)定5 min后并參照退出電極后的電位水平為細胞RP大小。

1.3 實驗所用藥物

所用藥物用Krebs液配制，通過開關控制藥物灌流標本，保持灌流速度、溫度和其它成分不變。所用藥物ACh由Sigma Research Biochemicals Inc.提供。

1.4 統(tǒng)計方法

采用SPSS 16.0統(tǒng)計軟件進行分析，實驗結果以均數(shù)±標準差()表示，顯著性采用 t檢驗。

2 結果

2.1 CA細胞RP獨特的雙峰分布

實驗中共成功記錄了112個細胞，RP范圍為-88～-26 mV，細胞平均RP為(-65±4.2)mV。應用高斯函數(shù)擬合后細胞RP呈雙峰分布，兩個峰值分別為-43 mV和-74 mV，分別稱為高和低RP(圖1)。實驗中我們觀察了10mmol/L K+和3μmol/L ACh對高、低RP細胞的作用。在低RP細胞，高K+和ACh引起去極化反應(圖 2A)，10mmol/L K+和 3μmol/L ACh引起的去極化幅度分別為(9.6±1.2)mV(n=23)和(8.7±0.69)mV(n=15)。在高 RP細胞，高K+和ACh引起超極化反應(圖2B)，10mmol/L K+和3μmol/L ACh引起的超極化幅度分別為(-7.4±0.87)mV(n=13)和(-15±1.2)mV(n=16)。

Fig.1 Two-peak distribution of CA cell RP

Fig.2 Responses induced by high K+and ACh in high and low RP cells

2.2 Kir介導CA細胞RP的雙峰分布

實驗中預灌流Kir阻斷劑Ba2+，結果發(fā)現(xiàn)Ba2+可以濃度依賴的去極化低RP細胞(圖 3A)，1、3、10、30、100、300、1000、3000μmol/L 的 Ba2+引起 CA 細胞去極化幅度分別為(0.45±0.27)mV(n=4)、(0.48±0.24)mV(n=4)、(3.6±0.82)mV(n=7)、(6.7±0.96)mV(n=10)、(16±1.5)mV(n=11)、(37±3.7)mV(n=11)、(36±3.2)mV(n=7)、(45±2.4)mV(n=7)，EC50是 120μmol/L(圖 3B)。應用 ≥100μmol/L Ba2+后低RP細胞去極化到高RP水平，ACh介導反應的形式也發(fā)生相應改變，圖4顯示CA細胞初始為低 RP水平，3μmol/L ACh引起去極化反應 ，持續(xù)灌流 100μmol/L Ba2+阻斷 Kir后 ，細胞去極化到高RP水平，此時3μmol/L ACh引起超級化反應。

Fig.3 Effect of Ba2+on RP of CA cells

Fig.4 Kirmediated conversion between high and low RP of CA

3 討論

微動脈是小動脈的末梢分支，直徑在5～100μm之間，和小動脈共同決定了血管的外周阻力。目前已知微動脈上表達的主要功能性K+通道包括鈣激活的 K+通道(Ca2+-activated K+channels，KCa)、ATP敏感的 K+通道(ATP-sensitive K+channels，KATP)、Kir和電壓依賴K+通道(voltage-gated K+channels，KV)[6]。其中Kir是維持微動脈細胞RP的重要通道[7]。Kir通道主要表達在小直徑的微動脈上。目前認為Kir通道主要參與維持微動脈細胞RP和血管緊張度調節(jié)[7]。Kir也被認為是微動脈自身調節(jié)的關鍵跨膜蛋白[3]，在腦動脈、腎臟動脈、提睪肌和冠狀動脈基礎舒縮運動中，Kir通道發(fā)揮重要作用[8]。前期研究發(fā)現(xiàn)在離體豚鼠耳蝸螺旋動脈上血管細胞RP獨特的雙峰分布由Kir通道的激活或失活介導[4，5]，本實驗所得結果與之一致。

ACh不僅是神經(jīng)遞質，同時也是一種有效的血管舒張物質，參與許多血管床的調節(jié)活動。研究發(fā)現(xiàn)，在微動脈上ACh可引起雙向反應[5]，既引起細胞超極化反應也可以引起去極化反應。當內皮細胞功能完整時，ACh引起血管平滑肌細胞超極化并舒張血管，剝除內皮細胞層后，ACh引起血管平滑肌細胞去極化反應并收縮血管[9]。目前普遍認為ACh引起細胞超極化反應和舒張血管是由內皮超極化因子或內皮舒張因子介導。在豚鼠耳蝸螺旋動脈上我們證實ACh通過激活內皮細胞膜上的KCa通道，致使K+外流，引起內皮細胞超極化反應[11]。對于血管平滑肌細胞來說，ACh引起超極化反應幅度的60%是由內皮細胞經(jīng)內皮細胞與平滑肌細胞之間的縫隙連接通道傳來，剩余的40%則是內皮細胞釋放到細胞外的K+，導致[K+]o濃度升高，激活血管平滑肌細胞上的Kir和Na+-K+泵引起。另一方面，直到現(xiàn)在ACh引起去極化和收縮血管的機制仍不清楚。在豚鼠耳蝸螺旋動脈上我們證實ACh通過激活非選擇性的陽離子通道和失活Kir通道引起細胞去極化反應[10]。本實驗中也發(fā)現(xiàn)在CA細胞上ACh引起雙向反應，既在高RP細胞上引起超極化反應，而在低RP細胞上引起去極化反應。在后期的工作中ACh在CA上引起去極化和超極化的離子機制將是我們重點研究內容。

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