顧 斌 劉洪臣 馬軍利 郭 宏

神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)c-fos蛋白的表達(dá)及分布特點(diǎn)可以做為生物學(xué)指標(biāo)，衡量外周刺激引起相關(guān)神經(jīng)元的傷害性反應(yīng)，探索神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)的調(diào)節(jié)變化機(jī)制。本實(shí)驗(yàn)在前期建立大鼠急性牙髓炎模型的基礎(chǔ)上，通過測定牙髓炎致敏過程中延髓中三叉神經(jīng)脊束核極間亞核和孤束核c-fos蛋白的表達(dá)情況，研究c-fos變化規(guī)律。

1.材料與方法

1.1 動(dòng)物模型及實(shí)驗(yàn)分組 選取SD大鼠30只，將其平均分為5組，一組為正常對(duì)照組，其余4組為實(shí)驗(yàn)組，分別為開髓后封脂多糖(Lipopolysac charide，LPS)6小時(shí)、12小時(shí)、24小時(shí)、48小時(shí)組[1]。

1.2 材料 兔抗c-fos抗體(武漢博士德生物工程有限公司)；二步法免疫組化試劑盒(中山金橋生物技術(shù)公司)，DAB試劑盒(中山金橋生物技術(shù)公司)。

1.3 免疫組化實(shí)驗(yàn) 在預(yù)定時(shí)間點(diǎn)灌注取出延髓，置于4%多聚甲醛固定液中固定10h(4℃)。制備石蠟切片，以閂平面為基準(zhǔn)，連續(xù)切片，片厚40μm，每5張取1片；尾側(cè)切取8組切片，長約1.6mm，吻側(cè)切取5組切片，長約1mm(包含Vc核)，置于4℃保存，切片均由解放軍總醫(yī)院病理科制備。

取一套切片脫蠟；3%H2O2室溫孵育5-10min，將切片放入盛有枸櫞酸鹽緩沖液的容器中，置微波爐內(nèi)加熱使容器內(nèi)液體溫度保持在92℃-98℃之間并持續(xù)10-15min，取出容器，室溫冷卻10-20min，PBS洗5min；5-10%正常山羊血清(PBS稀釋)封閉，室溫孵育30min。傾去血清，滴加適當(dāng)比例稀釋的一抗，37℃孵育1-2h或4℃過夜(同時(shí)做不加一抗的陰性對(duì)照)；PBS沖洗后滴加適當(dāng)比例稀釋的二抗稀釋液，37℃孵育30min；DAB顯色；另取一套切片不加抗體做為陰性對(duì)照組。

每張切片相應(yīng)的核團(tuán)均取四個(gè)高倍視野，計(jì)數(shù)c-fos陽性神經(jīng)元數(shù)目，計(jì)算各組動(dòng)物Vi和NTS內(nèi)c-fos表達(dá)數(shù)目的均值,以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示。

1.4 統(tǒng)計(jì)分析 統(tǒng)計(jì)過程采用SPSS軟件進(jìn)行方差分析。

2.結(jié)果

用免疫組化方法觀察c-fos在Vi核、孤束核的表達(dá)情況。陽性細(xì)胞計(jì)數(shù)結(jié)果見表1，總體變化趨勢見圖1-圖3。

在LPS致急性牙髓炎致敏后，與對(duì)照組相比，實(shí)驗(yàn)側(cè)Vi核c-fos陽性神經(jīng)元表達(dá)數(shù)目明顯增加(p＜0.01)，并呈時(shí)間依賴性，從6小時(shí)至12小時(shí)表達(dá)上升；對(duì)側(cè)Vi核的c-fos表達(dá)數(shù)目少于實(shí)驗(yàn)側(cè)(p＜0.01)，變化趨勢為逐漸增多(圖1、圖2)。

與對(duì)照相比，在炎癥形成的全程(6h至48h)，雙側(cè)孤束核的c-fos陽性神經(jīng)元數(shù)目均顯著增加(p＜0.01)，6h最高，之后隨時(shí)間增加而逐漸降低(圖 3)。

3.討論

圖1 牙髓炎致敏后Vi、NTS核實(shí)驗(yàn)側(cè)c-fos陽性神經(jīng)元數(shù)變化趨勢圖(*p＜0.01，與前一時(shí)間點(diǎn)比較)

圖2 Vi核實(shí)驗(yàn)側(cè)和對(duì)側(cè)fos陽性神經(jīng)元表達(dá)變化趨勢(#p＜0.01,與對(duì)側(cè)對(duì)比 *p＜0.01，與前一時(shí)間點(diǎn)比較)

圖3 孤束核實(shí)驗(yàn)側(cè)和對(duì)側(cè)c-fos陽性神經(jīng)元表達(dá)變化趨勢(#p＜0.01,與對(duì)側(cè)對(duì)比 *p＜0.01，與前一時(shí)間點(diǎn)比較)

表1 急性牙髓炎致敏大鼠Vi核、孤束核c-fos蛋白的陽性表達(dá)數(shù)目(均值±SD)

機(jī)體接受不同傷害性刺激時(shí)，中樞神經(jīng)系統(tǒng)可發(fā)生功能和結(jié)構(gòu)的變化，此時(shí)，腦干中相關(guān)核團(tuán)c-fos的時(shí)空分布出現(xiàn)特定的變化規(guī)律，反映中樞致敏的具體信息[2]。皮膚損傷、關(guān)節(jié)損傷、內(nèi)臟損傷會(huì)造成中樞神經(jīng)系統(tǒng)c-fos蛋白不同的表達(dá)模式。研究c-fos蛋白的變化對(duì)理解外周炎癥與外周神經(jīng)系統(tǒng)、中樞神經(jīng)系統(tǒng)致敏的相互關(guān)系具有重要的意義，對(duì)于后期疼痛的治療也很有幫助。

在前期的實(shí)驗(yàn)中，我們研究大鼠急性牙髓炎造成中樞致敏時(shí)Vc核內(nèi)c-fos蛋白的變化情況，發(fā)現(xiàn)在封藥后12h至24h，Vc核c-fos陽性神經(jīng)元表達(dá)數(shù)目顯著增多[3]。

有研究證實(shí)，三叉神經(jīng)脊束核的Vi核也參與了牙齒感覺信號(hào)的傳遞過程，一些電生理和c-fos研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)牙髓接受化學(xué)刺激或電刺激時(shí)，Vi的神經(jīng)元會(huì)被激活[4,5]。神經(jīng)解剖學(xué)研究也證實(shí)，三叉神經(jīng)脊束核吻側(cè)亞核(Vo)的神經(jīng)元部分直接投射到Vc核,而支配牙髓感覺的傳入神經(jīng)纖維直接投射到Vo，Vi[6]。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)位于Vc核吻側(cè)的Vi核神經(jīng)元c-fos表達(dá)變化趨勢類似于VC核團(tuán)，只是陽性神經(jīng)元的密度低于尾側(cè)亞核，與對(duì)照組相比，實(shí)驗(yàn)側(cè)Vi核6-48小時(shí)表達(dá)均增強(qiáng)(p＜0.01),說明Vi參與了中樞致敏的進(jìn)程。在2007年，worsley等[7]對(duì)牙齒施加電刺激，發(fā)現(xiàn)Vi區(qū)沒有明顯的c-fos表達(dá)。這可能是由于動(dòng)物種屬和刺激方式的差異造成的。

在本研究中，對(duì)側(cè)Vi核在24小時(shí)以后才表達(dá)增加(p＜0.01)，這可能是由于Vi的神經(jīng)元電生理特點(diǎn)類似與VC深層的神經(jīng)元，含有較多的廣動(dòng)力(wide-dynamic-range WDR)神經(jīng)元，神經(jīng)信號(hào)需要通過多級(jí)傳導(dǎo)才能激活。

實(shí)驗(yàn)中，我們觀察到雙側(cè)孤束核均出現(xiàn)了急性的c-fos表達(dá)增高現(xiàn)象，在6h最高，以后逐漸降低(圖3)，這可能與動(dòng)物的情感及應(yīng)激性刺激有關(guān),需要進(jìn)一步研究分析。

本研究進(jìn)一步說明在大鼠牙髓炎發(fā)展進(jìn)程中，中樞相關(guān)核團(tuán)的變化情況，反映出中樞致敏與牙髓炎進(jìn)展的相關(guān)性。

[1]顧 斌，劉洪臣，馬軍利，等.大鼠急性牙髓炎動(dòng)物模型的建立[J].中華老年口腔醫(yī)學(xué)雜志，2009，7(5)：304-307

[2]Navarro VP,Rocha MJ,Branco LG.Reduced central c-fos expression and febrile response to repeated LPS injection into periodontal tissue of rats[J].Brain Res,2007，1152：57-63

[3]顧 斌，劉洪臣，馬軍利，等.急性牙髓炎致敏時(shí)Vc核c-fos蛋白的時(shí)程變化[J].中華老年口腔醫(yī)學(xué)雜志，2010，8(6)：321-323

[4]Allen GV,Barbrick B,Esser MJ.Trigeminal-parabrachial connections：possiblepathway for nociception-induced cardiovascular reflex responses[J].Brain Res， 1996， 715(1-2)：125-135

[5]Hamba M.Stimulation-induced responses of the trigeminal caudal neurons in the brainstem preparation isolated from newborn rats[J].Brain Res，1998，785(1)：66-74

[6]Marfurt CF,Turner DF.The central projections of tooth pulp afferent neurons in the rat as determined by the transganglionic transport of horseradish peroxidase[J].J Comp Neurol,1984，223(4)：535-547

[7]Worsley MA,Davies SL,Clayton NM,et al.The effect of inflammation on Fos expression in the ferret trigeminal nucleus[J].Eur J Oral Sci，2007，115(1)：40-47