劉加強(qiáng) 劉洪臣 馮 元 高 輝

Caspase家族是近幾年研究的熱點(diǎn)之一，屬于ICE/CED3蛋白酶家族成員，現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)至少有14種。該家族與細(xì)胞凋亡密切相關(guān)，它是通過(guò)級(jí)聯(lián)放大反應(yīng)，最終激活核酸內(nèi)切酶來(lái)實(shí)現(xiàn)介導(dǎo)細(xì)胞凋亡的[1]。在眾多的Caspase家族成員中，Caspase-3處于凋亡環(huán)節(jié)的核心部位，對(duì)整個(gè)細(xì)胞凋亡過(guò)程起著決定性作用[2]，因此，本實(shí)驗(yàn)?zāi)康脑谟谔接慍aspase-3在高糖環(huán)境下引起的體外人牙周膜細(xì)胞凋亡過(guò)程中的作用。本實(shí)驗(yàn)分別采用葡萄糖濃度為5.5mmol/L，15mmol/L，25mmol/L，35mmol/L的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)人牙周膜細(xì)胞，時(shí)間為24小時(shí)，并采用Caspase-3特異性抑制劑z-DEVD-fmk為對(duì)照，流式細(xì)胞儀檢測(cè)各組細(xì)胞凋亡情況，Western-blot法檢測(cè)Caspase-3蛋白酶原(procaspase-3)和裂解后有活性的蛋白酶(cleaved Caspase-3)變化情況，明確Caspase細(xì)胞凋亡通路在此過(guò)程中的作用。

1.材料與方法

1.1 材料

z-DEVD-fmk(Santa cruz)，β-actin 兔多克隆抗體(Santa cruz)，蛋白質(zhì)分子量Marker(天根生化科技有限公司，北京)，顯影液定影液(尚柏生物PCP010，北京)，DYCP-31D型水平式電泳槽(賓達(dá)英創(chuàng)科技有限公司，北京)，DYY-7C型電泳儀(六一儀器廠，北京)，溫控超速離心機(jī)(Eppendorf，Germany)，轉(zhuǎn)膜儀(J-MAX)。

1.2 方法

本實(shí)驗(yàn)采用組織塊法、酶消化法和蓋玻片固定相結(jié)合進(jìn)行人牙周膜細(xì)胞的原代培養(yǎng)。取因正畸治療拔除的的健康前磨牙4顆，用含有1000單位/升青霉素和鏈霉素的0.01mol/L PBS反復(fù)沖洗后，無(wú)菌條件下，用銳利的刀片刮取根中1/3區(qū)域的牙周膜組織，0.3%Ⅰ型膠原酶5毫升消化30min，1500轉(zhuǎn)/分離心5min，棄上清液，沉淀物用2毫升含20%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基重懸洗滌，1200轉(zhuǎn)/分離心5 min，棄上清液，沉淀物平鋪于6孔培養(yǎng)板中，用洗凈并消毒的蓋玻片壓緊，防止加入培養(yǎng)液時(shí)組織塊浮起，加入1.5毫升含20%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基在37℃、5%CO2、飽和濕度條件下于恒溫孵箱中靜置培養(yǎng)。

1.2.1 實(shí)驗(yàn)分組

本實(shí)驗(yàn)共分五組，每組3個(gè)樣本：

第一組：葡萄糖濃度為5.5mmol/L

第二組：葡萄糖濃度為15mmol/L

第三組：葡萄糖濃度為25mmol/L

第四組：葡萄糖濃度為35mmol/L

第五組：葡萄糖濃度為35mmol/L，該組中加入Caspase-3特異性抑制劑z-DEVD-fmk，濃度為2μmol/L。采用流式細(xì)胞儀定量檢測(cè)每組細(xì)胞凋亡情況，Western-blot法檢測(cè)Caspase-3蛋白酶原(procaspase-3)和裂解后有活性的蛋白酶(cleaved Caspase-3)變化情況。

1.2.2 實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

運(yùn)用SPSS13.0軟件包，對(duì)所得結(jié)果進(jìn)行單因素方差分析，P＜0.05為具有顯著性差異。

2.結(jié)果

細(xì)胞培養(yǎng)的最初3d，倒置顯微鏡下未見有成纖維樣細(xì)胞爬出，隨著培養(yǎng)時(shí)間延長(zhǎng)，在接種后7－10d左右可見組織塊周圍有少量細(xì)胞長(zhǎng)出，貼壁生長(zhǎng)，以組織塊為中心，呈放射狀排列。15d左右細(xì)胞彼此接觸融合成片，大約達(dá)到24孔板底面的80%，個(gè)別部位有細(xì)胞重疊現(xiàn)象，此時(shí)應(yīng)進(jìn)行傳代。5～8代的細(xì)胞形態(tài)一致，性質(zhì)穩(wěn)定，立體感強(qiáng)，生長(zhǎng)狀況良好，適合進(jìn)行有關(guān)的研究實(shí)驗(yàn)。

2.1 流式細(xì)胞儀結(jié)果

流式細(xì)胞儀定量分析各組凋亡細(xì)胞百分比，每組三個(gè)樣本：

第一組：葡萄糖濃度為5.5mmol/L，24小時(shí)2.6%，3.4%，3.1%

第二組：葡萄糖濃度為15mmol/L，24小時(shí)3.7%，4.1%，2.6%

第三組：葡萄糖濃度為25mmol/L，24小時(shí)4.4%，5.2%，5.6%

第四組：葡萄糖濃度為35mmol/L，24小時(shí)6.3%，7.5%，7.6%

第五組：糖35mmol/L+z-DEVD-fmk，24小時(shí) 4.1%，5.7%，5.3%

每組均值及方差及凋亡情況對(duì)比情況見圖1，2。

圖1 各組細(xì)胞凋亡百分比與5.5mmol/L比較：**P＜0.01

從表中可以看出，總體趨勢(shì)是隨著葡萄糖濃度的增高，牙周膜細(xì)胞凋亡比例升高，但總的細(xì)胞凋亡比例均小于10%，說(shuō)明各組凋亡的細(xì)胞只占到很小一部分，大部分細(xì)胞沒(méi)有發(fā)生凋亡。

圖2 各組細(xì)胞凋亡百分比與5.5mmol/L比較：**P＜0.01；與35mmol/L+DEVD組比較：##P＜0.01

從表中可以看出，Caspase-3特異性抑制劑z-DEVD-fmk可以顯著抑制高糖引發(fā)的牙周膜細(xì)胞凋亡，說(shuō)明Caspase-3細(xì)胞凋亡途徑參與了這一過(guò)程。但z-DEVD-fmk不能夠完全抑制高糖引發(fā)的牙周膜細(xì)胞凋亡，說(shuō)明除了Caspase-3細(xì)胞凋亡途徑外，還有其他途徑參與了這一過(guò)程。

2.2 Caspase-3蛋白表達(dá)結(jié)果

Western-blot法測(cè)定每組 Caspase-3酶原(pro-caspase-3)和 活 性 Caspase-3(cleaved Caspase-3)蛋白含量，電泳后采用軟件分析各組染色條帶灰度值，實(shí)驗(yàn)重復(fù)三次后用SPSS13.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，結(jié)果見圖3。

圖3 pro-caspase-3以及cleaved Caspase-3蛋白含量變化情況與5.5mmol/L比較：*P＜0.05，**P＜0.01

從表中可以看出，隨著糖濃度的增加，cleaved Caspase-3含量逐漸增加，說(shuō)明細(xì)胞凋亡活動(dòng)逐漸增強(qiáng)，但pro-caspase-3濃度沒(méi)有變化，說(shuō)明發(fā)生凋亡的細(xì)胞只占了很小一部分比例，大部分細(xì)胞沒(méi)有發(fā)生凋亡，這點(diǎn)與流式細(xì)胞儀結(jié)果相一致。大量正常活細(xì)胞內(nèi)的pro-caspase-3含量掩蓋了小部分凋亡細(xì)胞內(nèi)因活化而減少的pro-caspase-3，因此檢測(cè)不出變化。而cleaved Caspase-3在正常細(xì)胞內(nèi)沒(méi)有或是含量甚微，因此少量的變化即可被檢測(cè)出來(lái)。加入Caspase-3特異性抑制劑z-DEVD-fmk后cleaved Caspase-3的含量與35mM組比較沒(méi)有變化，說(shuō)明z-DEVD-fmk并不能抑制procaspase-3被活化成cleaved Caspase-3，只能抑制cleaved Caspase-3的活性。

3.討論

Caspase即半胱氨酸天門冬氨酸蛋白酶，是一組具有相似的氨基酸序列和二級(jí)結(jié)構(gòu)的半胱氨酸蛋白酶，不但與真核細(xì)胞凋亡密切相關(guān)，還參與多種細(xì)胞因子的成熟、細(xì)胞生長(zhǎng)以及分化[3-6]。Caspase的底物種類較多，但主要對(duì)象是DNA修復(fù)調(diào)節(jié)因子、細(xì)胞骨架、RNA剪接以及細(xì)胞周期中的某些成員，而不是廣泛地降解多種蛋白質(zhì)。Caspase抑制劑可分為人工合成的酶抑制劑、天然的酶抑制劑與拮抗Caspase酶作用的三類。人工合成的抑制劑主要作用部位是Caspase活性中心，分為肽類和非肽類抑制劑，其中肽類抑制劑因?yàn)樘禺愋愿撸子诤铣?，成本較低，因而被廣泛應(yīng)用，如z-DEVD-fmk，Ac-DEVD-CHO等。

根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)及參考文獻(xiàn)[7,8]，我們選擇葡萄糖濃度為5.5mmol/L，15mmol/L，25mmol/L，35mmol/L的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)人牙周膜細(xì)胞，高糖作用時(shí)間為24小時(shí)，因人體內(nèi)正常血糖濃度大約為5.5mmol/L，因此本實(shí)驗(yàn)中葡萄糖濃度為5.5mmol/L的實(shí)驗(yàn)組可看作是生理對(duì)照組。z-DEVD-fmk作為實(shí)驗(yàn)室常用的Caspase-3特異性抑制劑已被廣泛應(yīng)用，因此本實(shí)驗(yàn)選擇z-DEVD-fmk作為抑制劑對(duì)照，終濃度為2μmol/L，在加入葡萄糖前2小時(shí)加入[9]，以明確Caspase通路在此過(guò)程中的作用。

從本實(shí)驗(yàn)流式細(xì)胞儀結(jié)果中可以看出，隨著糖濃度的增高，牙周膜細(xì)胞凋亡比例也隨之增加，說(shuō)明高糖可以引發(fā)人牙周膜細(xì)胞的凋亡，與以往文獻(xiàn)報(bào)道相一致[10,11]，但凋亡比例都不高，都在10%以下，與體內(nèi)實(shí)際情況相一致，加入Caspase-3抑制劑z-DEVD-fmk后，細(xì)胞凋亡比例明顯低于未加入組，說(shuō)明z-DEVD-fmk可以抑制高糖引起的牙周膜細(xì)胞凋亡，這進(jìn)一步證實(shí)了高糖引起的牙周膜細(xì)胞凋亡是由Caspase-3介導(dǎo)的。此外，z-DEVD-fmk組細(xì)胞凋亡比例明顯高于生理糖濃度組，這說(shuō)明z-DEVD-fmk不能完全阻斷高糖引起的牙周膜細(xì)胞凋亡，這種情況有兩種可能，第一，z-DEVD-fmk并不能完全抑制Caspase-3功能，只降低其活性，Caspase-3仍然可以發(fā)揮部分介導(dǎo)細(xì)胞凋亡的作用。因此就會(huì)出現(xiàn)加入z-DEVD-fmk后的高糖組細(xì)胞凋亡百分比低于不加入z-DEVD-fmk的高糖組，但卻高于生理糖濃度組。第二，z-DEVD-fmk可以完全抑制Caspase-3功能，但這一凋亡過(guò)程并不是完全是由Caspase-3介導(dǎo)的，還存在其他調(diào)控途徑，因此加入z-DEVD-fmk后只能抑制Caspase-3介導(dǎo)的這部分細(xì)胞凋亡，卻并不能抑制其他途徑介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡，因此也會(huì)出現(xiàn)上述的結(jié)果。但具體是哪種機(jī)制還需證實(shí)。對(duì)Caspase-3的檢測(cè)結(jié)果可以看出，隨著糖濃度的增加，雖然未裂解的無(wú)活性的酶原pro-caspase-3濃度沒(méi)有變化，但有裂解后有活性的cleaved Caspase-3含量逐漸增加，說(shuō)明細(xì)胞凋亡活動(dòng)逐漸增強(qiáng)，但發(fā)生凋亡的細(xì)胞只占了總量的很小一部分比例，大部分細(xì)胞沒(méi)有發(fā)生凋亡現(xiàn)象，這點(diǎn)與體內(nèi)實(shí)際情況和流式細(xì)胞儀結(jié)果相一致。大量正?；罴?xì)胞內(nèi)的pro-caspase-3含量掩蓋了小部分凋亡細(xì)胞內(nèi)因活化而減少的pro-caspase-3，而且即使在少部分發(fā)生凋亡的細(xì)胞內(nèi)，也不是所有的pro-caspase-3酶原均發(fā)生了裂解活化，因此檢測(cè)不出變化。而cleaved Caspase-3在正常活細(xì)胞內(nèi)沒(méi)有或是含量甚微，因此少量的變化即可被檢測(cè)出來(lái)。加入Caspase-3特異性抑制劑z-DEVD-fmk后cleaved Caspase-3的含量與35mM組比較沒(méi)有變化，說(shuō)明z-DEVD-fmk并不能抑制pro-caspase-3被活化成cleaved Caspase-3，只能抑制cleaved Caspase-3的活性。

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