(中國醫(yī)科大學(xué)附屬盛京醫(yī)院，沈陽110004)

米托蒽醌是一種廣譜的抗腫瘤類藥物，其抗腫瘤活性高，而且抗瘤譜廣泛。多西紫杉醇是近幾年開發(fā)出的抗腫瘤新藥，具有獨(dú)特的抗癌作用機(jī)制，其抗瘤譜廣。2010年3～8月，本研究采用米托蒽醌聯(lián)合多西紫杉醇治療乳腺癌細(xì)胞，通過免疫組化、Real-Time PCR和Western blot等技術(shù)，檢測相關(guān)基因表達(dá)情況變化，探討米托蒽醌和多西紫杉醇聯(lián)合作用對乳腺癌治療的作用。

1 材料與方法

1.1 試劑 高糖DMEM培養(yǎng)基購自Thermo Fisher公司，MCF-7細(xì)胞購自上海細(xì)胞庫。米托蒽醌(Mitoxantrone)杭州民生藥廠，多西紫杉醇購自羅納普朗克樂安制藥有限公司，總RNA提取試劑盒、TIANScript cDNA第一鏈合成試劑盒2×Taq Real Master-Mix(SYBR Green)均購自天根生物科技(北京)有限公司，引物合成由上海生工公司完成，增殖細(xì)胞核抗原(PCNA)和Ki67單克隆抗體購于Abcam公司，免疫組化S-P試劑盒購自武漢博士德公司，其他為國產(chǎn)分析純。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng) MCF-7細(xì)胞培養(yǎng)于含有10%胎牛血清的高糖DMEM培養(yǎng)基中，在37℃、5%CO2飽和濕度條件下的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，細(xì)胞貼壁生長。每2～3 d傳代1次，實(shí)驗均選用對數(shù)生長期細(xì)胞。

1.3 模型建立及分組 建立裸鼠皮下移植瘤模型，取對數(shù)生長期MCF-7細(xì)胞，細(xì)胞濃度為5×106個細(xì)胞/m l，分別接種于裸鼠右前肢腋下部皮下接種。裸鼠在SPF條件下飼養(yǎng)，室溫21～25℃，相對濕度60% ～70%，皮膚消毒后將細(xì)胞懸液接種于裸鼠右腋皮下，每只注射0.2 ml細(xì)胞。36只造模成功裸鼠隨機(jī)分為4組，A組為對照組:生理鹽水1 ml/100 g腹腔注射;B組為米托蒽醌治療組:注射米托蒽醌20 mg/kg;C組為多西紫杉醇治療組:腹腔注射多西紫杉醇30 mg/kg;D組為米托蒽醌聯(lián)合多西紫杉醇治療組:腹腔注射米托蒽醌20 mg/kg和多西紫杉醇30 mg/kg。治療3周后處死所有裸鼠，剖腹取瘤組織。

1.4 抑瘤率實(shí)驗 完整剝離腫瘤，電子天平稱重，稱取瘤質(zhì)量，計算腫瘤抑制率。瘤組織迅速經(jīng)甲醛固定，常規(guī)石蠟包埋切片。

1.5 PCNA及Ki67蛋白檢測 應(yīng)用免疫組化S-P法，按照試劑盒使用說明書檢測組織中PCNA及Ki67蛋白表達(dá)，400倍顯微鏡鏡下每例隨機(jī)取10個視野，計數(shù)PCNA與Ki67的標(biāo)記指數(shù)，按陽性細(xì)胞百分率分為:陽性細(xì)胞率＜5%為陰性(－)，5%≤陽性細(xì)胞率＜40%為1級(+)，40%≤陽性細(xì)胞率＜70%為2級(++)，70%≤陽性細(xì)胞率為3級(+++)。

1.6 磷酸酶和張力蛋白同源基因(PTEN)表達(dá)檢測Western blot法檢測組織標(biāo)本中PTEN蛋白的表達(dá)，嚴(yán)格按說明書進(jìn)行操作。

1.7 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS13.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)處理，計量資料用±s表示，組間比較采用t檢驗，計數(shù)資料組間比較采有χ2檢驗。以P≤0.05為有統(tǒng)計學(xué)差異。

2 結(jié)果

2.1 腫瘤生長分析 見表1。

表1 各組治療結(jié)束時腫瘤質(zhì)量及其抑瘤率比較

2.2 PCNA及Ki67蛋白表達(dá) PCNA陽性表達(dá)位于細(xì)胞核，A 組(0～3級:0、5.23%、31.27%、63.50%)無陰性，大多為3級陽性表達(dá)，B組(0～3級:0、18.16%、39.71%、42.13%)的陽性表達(dá)主要集中在 1、2級，與 C組(0～3級:0、31.14%、30.82%、38.04%)之間無差異，D 組(0 ～3 級:0、45.74%、27.83%、26.43%)的陽性表達(dá)主要集中在1級，P＜0.05。Ki67蛋白陽性表達(dá)，A 組(0～3級:0、10.75%、28.41%、60.84%)Ki67 蛋白的陽性表達(dá)主要集中在3級，而在B組(0～3級:0、13.56%、58.34%、28.10%)和 C 組(0 ～3 級:0、19.75%、45.57%、34.68%)中 Ki67蛋白的陽性表達(dá)主要為2 級，D 組(0 ～3 級:8.76%、35.28%、25.52%、30.44%)1 級陽性表達(dá)升高，P ＜0.05。

2.3 PTEN蛋白表達(dá) PTEN蛋白的表達(dá)量在A、B、C和D組中依次升高，P＜0.05。見圖1。

3 討論

圖1 各組PTEN蛋白表達(dá)

米托蒽醌是一種較新型的蒽環(huán)類藥物，其抗腫瘤活性相當(dāng)或略高于阿霉素，其作用機(jī)制可能是抑制RNA及DNA合成，直接插入DNA堿基對之間干擾轉(zhuǎn)錄過程，阻止mRNA的形成而起到抗腫瘤作用，米托蒽醌可與很多常用抗腫瘤藥有協(xié)同作用［2］。多西紫杉醇是一種半合成的紫杉類化合物，是一種近年來常用來治療乳腺癌有效的藥物［3］。

本研究采用米托蒽醌、多西紫杉醇單獨(dú)用藥和米托蒽醌聯(lián)合多西紫杉醇治療乳腺癌成瘤裸鼠，通過免疫組化及Western blot等技術(shù)，檢測腫瘤組織中PCNA［4］、Ki67［5］及 PTEN［6］蛋白的表達(dá)情況，探討米托蒽醌和多西紫杉醇聯(lián)合對乳腺癌治療的作用機(jī)制。研究發(fā)現(xiàn)，應(yīng)用米托蒽醌治療后，腫瘤得到一定的治療，多西紫杉醇的治療情況與米托蒽醌的治療情況相似，而米托蒽醌聯(lián)合多西紫杉醇聯(lián)合用藥較單獨(dú)米托蒽醌或多西紫杉醇治療的效果更好，移植瘤的抑瘤率上升，腫瘤組織中PCNA蛋白和Ki67蛋白的陽性表達(dá)率下降，PTEN蛋白水平表達(dá)上升，其變化情況較為治療組有顯著差異。結(jié)果表明，米托蒽醌聯(lián)合多西紫杉醇可能通過抑制致癌基因的表達(dá)，阻斷腫瘤細(xì)胞中的蛋白質(zhì)合成，抑制腫瘤細(xì)胞的增殖和癌癥的發(fā)展，為新輔助化療乳腺癌的聯(lián)合用藥進(jìn)一步研究奠定一定的基礎(chǔ)。

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