趙世彬，甄秀麗*，孫海茹，張 娜，乜照燕，張 軼

(1河北醫(yī)科大學(xué)第四醫(yī)院，石家莊050011;2衡水哈勵遜國際和平醫(yī)院)

目前體外受精—胚胎移植(IVF)妊娠率不斷提高，但有患者胚胎評分好仍不能妊娠。這使人們對不孕癥患者著床方面的缺陷越來越重視，著床時胚胎和子宮內(nèi)膜的同步發(fā)育與相互配合是很重要的，其中，子宮內(nèi)膜的接受性又是一個關(guān)健性因素，自然成為一個研究熱點(diǎn)。使用抑制性消減雜交技術(shù)［1］(SSH)對差異表達(dá)基因片段進(jìn)行測序，建立了與子宮內(nèi)膜容受性相關(guān)的差異表達(dá)基因文庫，篩選出與子宮內(nèi)膜容受性相關(guān)基因，如galectin-3等。本研究通過檢測galectin-3在IVF失敗患者子宮內(nèi)膜中的表達(dá)，探討子宮內(nèi)膜容受性的分子基礎(chǔ)，為提高IVF妊娠率提供依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選擇2010年1～4月在河北醫(yī)科大學(xué)第四醫(yī)院生殖醫(yī)學(xué)科行IVF失敗患者11例作為研究組，不育原因?yàn)檩斅压芤蛩?例，子宮內(nèi)膜異位癥2例。對照組為10例同期行IVF妊娠者，前一周期排卵后6～7 d著床窗口期子宮內(nèi)膜采用逆轉(zhuǎn)錄PCR(RT-PCR)技術(shù)和免疫組化技術(shù)檢測內(nèi)膜galectin-3表達(dá)。患者年齡24～39歲，不孕年限2～10 a。所有入選病例均符合以下條件:排卵前子宮內(nèi)膜厚度≥8 mm;形態(tài)三線或接近三線。

1.2 研究方法

1.2.1 子宮內(nèi)膜采集 選取有IVF指證者于IVF前一月經(jīng)周期第10～11日開始監(jiān)測卵泡，陰道B超采用日本ALOKA公司α-5彩色超聲儀，陰道探頭頻率為5 MHz。排卵后6～7 d用內(nèi)膜取樣器采集子宮內(nèi)膜部分液氮保存用于mRNA測定，部分4%甲醛固定用于免疫組化檢測。

1.2.2 控制性超排卵 排卵后6～7 d(黃體中期)給予醋酸曲普瑞林(德國輝凌制藥)0.1 mg/d，達(dá)到降調(diào)節(jié)標(biāo)準(zhǔn)后給予促性腺激素(Gonal-F，瑞士serone公司;hMG，麗珠制藥)，采用經(jīng)陰道超聲監(jiān)測子宮內(nèi)膜變化和卵泡生長情況，當(dāng)至少有3個卵泡直徑＞18 mm時，當(dāng)晚注射艾澤(瑞士serone公司)250 IU，注射后38 h左右取卵，體外受精，于取卵后3 d胚胎移植，移植后21 d B超子宮內(nèi)看到孕囊為臨床妊娠。

1.2.3 子宮內(nèi)膜RT-PCR檢測技術(shù) 分別取研究組及對照組子宮內(nèi)膜各約50 mg加入Rezol 1 ml置勻漿器內(nèi)充分勻漿，提取總RNA，取出1.5μg，進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄得cDNA，繼而進(jìn)行PCR擴(kuò)增。galectin-3上游引物序列為:5'-GAATGATGTCTTCCAC-3'，下游引物序列為:5'-CACTGGTGAGGTCTATGTCAC-3'，擴(kuò)增片段長度為278 bp。同時以擴(kuò)增片段長度為540 bp的β-actin作為內(nèi)參照。PCR循環(huán)條件為:94℃5 min，1 個循環(huán);94 ℃ 40 s，50 ℃ 40 s，72 ℃ 50 s，30個循環(huán);72℃ 10 min，1個循環(huán)。產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳后，用VDS圖像分析系統(tǒng)進(jìn)行照相和圖像分析。IOD值經(jīng)內(nèi)參照校正，將校正值進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。Rezol及反轉(zhuǎn)錄試劑盒均為北京賽百盛公司產(chǎn)品，galectin-3、β-actin引物由博亞生物技術(shù)公司設(shè)計(jì)，上海生工生物技術(shù)公司合成。

1.2.4 免疫組化檢測 galectin-3鼠單克隆抗體IgG1為CWBIO公司產(chǎn)品。二抗為通用型試劑盒。將子宮內(nèi)膜用4%甲醛固定后石蠟包埋，制備2μm厚連續(xù)組織切片。分別進(jìn)行HE和ABC免疫組化染色。脫蠟、消化、高壓抗原修復(fù)、封閉、加入一抗(單克隆小鼠抗人galectin-3稀釋濃度為1∶100)、二抗、DAB顯色、蘇木素復(fù)染、脫水后透明、中性樹膠封片。用PBS代替一抗做陰性對照。顯微鏡觀察并拍照。陽性判斷標(biāo)準(zhǔn):每張染色片隨機(jī)選取5個視野，以背景清晰、細(xì)胞質(zhì)著色呈棕黃色為陽性，分為4個等級:細(xì)胞均無任何陽性染色為“－”;25%以下細(xì)胞陽性染色為“+”;25% ～50%細(xì)胞陽性染色為“++”;50%以上細(xì)胞陽性染色“+++”。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 所有數(shù)據(jù)采用SPSS11.5軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料以±s表示，組間比較采用t檢驗(yàn);計(jì)數(shù)資料采用χ2檢驗(yàn)。以P≤0.05為有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

2 結(jié)果

2.1 一般情況比較 研究組與對照組年齡、不育年限、Gn天數(shù)、獲卵數(shù)、優(yōu)胚數(shù)等均無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，見表1。

表1 研究組與對照組一般資料比較(±s)

表1 研究組與對照組一般資料比較(±s)

獲卵數(shù) 優(yōu)胚數(shù)研究組 29.22 ±4.16 5.12 ±3.16 10.54 ±2.81 11.26 ±2.73組別 年齡(歲)不育年限(a)Gn天數(shù)(d)5.32 ±3.13對照組 28.41 ±4.15 4.98 ±4.44 10.44 ±3.13 11.55 ±2.275.19 ±4.25

2.2 galectin-3 mRNA的表達(dá) 見圖1。PCR半定量分析結(jié)果顯示，galectin-3 mRNA在研究組和對照組分別為0.11 ±0.18 和0.42 ±0.37，P ＜0.01。

圖1 2組著床窗口期子宮內(nèi)膜galectin-3 mRNA表達(dá)比較

2.3 galectin-3蛋白的表達(dá) galectin-3蛋白在腺體上皮細(xì)胞和基質(zhì)細(xì)胞均有表達(dá)，研究組的表達(dá)為“－”，對照組的表達(dá)為“++”。

3 討論

胚胎著床的成功依賴于子宮內(nèi)膜和胚胎的同步發(fā)育，子宮內(nèi)膜僅在特定而短暫的時期允許胚胎著床，這一時期被稱為“著床窗口期”，人類胚胎著床窗口期在排卵后第6～8天，即分泌中期。子宮內(nèi)膜容受性是受到母體激素作用下子宮內(nèi)膜局部因子的一系列時序性表達(dá)的基因調(diào)控，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)一些基因與子宮內(nèi)膜容受性建立有關(guān)，如細(xì)胞因子、黏附分子、糖復(fù)合物等。

在對胚泡著床的研究過程中，糖蛋白復(fù)合物的作用一直頗受重視，人們認(rèn)為這類物質(zhì)可以調(diào)節(jié)子宮內(nèi)膜的增殖、分化、遷移及黏附能力，而且胚胎和子宮內(nèi)膜的相互識別過程也可能通過糖復(fù)合物及其配體的相互作用建立。galectins是糖結(jié)合蛋白的一個家族，galectin-3是該家族的主要成員之一［2］，這類分子一方面通過與配體結(jié)合調(diào)節(jié)細(xì)胞生長、黏附和侵襲，同時又具有調(diào)節(jié)整聯(lián)蛋白與細(xì)胞外基質(zhì)分子的親和力的作用，galectin-3可與整聯(lián)蛋白α1β1結(jié)合［3］。雷彩霞等［4］發(fā)現(xiàn)應(yīng)用 RNA 干擾技術(shù)(siRNA)抑制gelectin-3表達(dá)后，人類子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞株RL95-2細(xì)胞G1期上升，S期下降;整聯(lián)蛋白β1表達(dá)下降;對細(xì)胞外纖維黏連蛋白黏附性顯著降低。von Wolff等報(bào)道galectin-3在人類分泌期子宮內(nèi)膜表達(dá)最高［5］，提示gelectin-3參與子宮內(nèi)膜功能和胚胎植入的調(diào)節(jié)。杜國平等［6］進(jìn)一步證實(shí)gelectin-3 mRNA和蛋白在分泌中期子宮內(nèi)膜的表達(dá)高于增生晚期，提示galectin-3可能參與了生殖過程的調(diào)節(jié)，與子宮內(nèi)膜容受性和胚胎的植入有關(guān)。

本研究結(jié)果顯示，子宮內(nèi)膜中g(shù)alectin-3 mRNA和蛋白表達(dá)在IVF失敗患者明顯低于妊娠組，可見IVF失敗患者胚胎著床障礙是主要原因之一。

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