姚 琦，姜 華，張立海，黃 鵬，崔 庚，唐佩福

(1首都醫(yī)科大學附屬北京世紀壇醫(yī)院，北京100038;2中國人民解放軍總醫(yī)院)

重組人骨形態(tài)發(fā)生蛋白2(rhBMP-2)等外源性生長因子的應用研究一直是組織修復再生和組織工程領域最活躍的課題之一。國內外學者進行了大量生長因子緩釋載體的研究［1～3］，其中聚乳酸聚乙醇酸共聚物(PLGA)不但具有生物相溶性好、無免疫反應等特點，而且可通過調節(jié)乳酸和乙醇酸二單體的比例得到不同降解速率的載體材料，因而目前被廣泛用作藥物載體材料。本實驗于2010年完成，旨在觀察骨形態(tài)發(fā)生蛋白微球對體外培養(yǎng)的犬骨髓基質細胞(MSC)增殖及分化影響。

1 材料與方法

1.1 主要試劑 PLGA購自山東省醫(yī)療器械研究所;rhBMP-2購自北京軍事醫(yī)學科學院;DMEM培養(yǎng)基購自美國Gibco公司;hhuyuyzaz肝素、抗壞血酸、地塞米松、β-甘油磷酸鈉、胰蛋白酶、牛血清白蛋白購自美國Sigma公司;堿性磷酸酶(ALP)試劑盒購自南京建成生物制品公司;PVA聚乙烯醇、二氯甲烷購自北京化學試劑公司;Ⅰ型膠原免疫組化試劑盒購自武漢博士德公司。

1.2 方法

1.2.1 骨形態(tài)發(fā)生蛋白微球制備 復乳—溶劑揮發(fā)法［4］制備微球，rhBMP-2干粉10 mg用鹽酸胍溶液溶解，取出100μl PBS的rhBMP-2溶液，并加適量的牛血清白蛋白做保護劑，混勻，形成內水相，100 mg的PLGA溶于0.7 ml二氯甲烷中形成油相(含2.5%司盤－20)，內水相加入油相中冰浴超聲乳化，形成初乳，將初乳加入到10ml外水相中(含1%PVA、0.5%吐溫 －20)，800 r/min攪拌 4 h揮盡溶劑，過濾，蒸餾水洗滌，真空凍干，4～8℃儲存。

1.2.2 犬MSC的分離與培養(yǎng) 實驗動物以10%戊巴比妥鈉25 mg/kg靜脈麻醉，腰骶部剃毛、消毒、鋪巾。以雙側髂后上棘連線中點為穿刺點，16號骨髓穿刺針用肝素鈉稀釋液預濕后刺入皮下。確定髂后上棘進針點，輕度斜向尾側進針3～4 mm，檢查穿刺針固定于髂骨上。取出針芯，連接10 ml注射器，內含肝素鈉稀釋液1 ml抽取骨髓液3～4 ml。穿刺針退至皮下，同法抽取對側髂骨骨髓液3～4 ml。將骨髓液緩慢貼壁加入預裝有淋巴細胞分離液的離心管，900 g離心30 min。輕輕用吸管沿試管周緣吸取收集中間云霧狀的白膜層(單核細胞層)，用5倍體積以上的 Hank’s液稀釋后，混勻，900 g離心10 min。細胞重懸后再次洗滌離心1次。收集細胞沉淀，用含15%FBS的DMEM培養(yǎng)液混勻后將細胞濃度調整至1×106/ml，將調整好濃度的單個細胞按4×105/cm2底面積接種于6～8個培養(yǎng)瓶中，置于37℃、5%CO2，飽和濕度下培養(yǎng)。4 d后首次換液。此后每4 d換液1次，篩除未貼壁生長的細胞。一般48 h后，有少量細胞貼壁，成仿錘形，4 d左右出現(xiàn)克隆，7 d出現(xiàn)致密貼壁層，10 d后貼壁細胞匯合可達80% ～90%。取胰蛋白酶250 mg，加入PBS溶液100 ml溶解，工作濃度為0.25%，無菌過濾分裝，冰箱－20℃冷凍保存，使用前37℃水浴復溫。倒置相差顯微鏡下觀察原代細胞匯合達90%時，即可進行傳代。棄去瓶中培養(yǎng)液，Hank’s液洗滌1次，加入0.25%胰蛋白酶1.0 ml，室溫下消化作用60～90 s。倒出消化液，加入含15%FBS的DMEM 10 ml，用吸管吸取培養(yǎng)液反復輕輕吹打瓶底貼壁細胞，使之形成細胞懸液。將其2/3量平均分至2個培養(yǎng)瓶中，加入培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)，傳至3代待用。

1.2.3 實驗分組 實驗組(rhBMP-2/PLGA微球):根據(jù)其包封率及載藥率計算加入同等量的rhBMP-2的載藥微球，最終DMEM培養(yǎng)液中rhBMP-2濃度為1μg/ml?？瞻讓φ战M:不含任何材料。

1.2.4 對MSC增殖的影響 取3塊96孔板，實驗組含rhBMP-2微球培養(yǎng)液，濃度設為1μg/ml。取生長良好的第3代MSC，調整細胞濃度至2×104個/ml，接種細胞于含10%FBS的DMEM中，每孔2×103個，每孔體積100μl。對照組僅加培養(yǎng)液，分別在第1、3、5天各取1板，每孔加入MTT溶液(5 mg/ml)20 μl，37℃，繼續(xù)孵育4 h，每孔加入150 μl的二甲基亞砜(DMSO)，振蕩10 min，然后用酶聯(lián)檢測儀在490 nm波長檢測光密度值(OD)，取4孔平均值進行統(tǒng)計學處理，以反映其對細胞增殖的影響。

1.2.5 對MSC分化的影響 細胞接種及實驗分組同上。ALP檢測:在上述相同時間點棄去培養(yǎng)液，每孔加入100μl 0.1%TritonX-100細胞裂解液，4℃過夜。混勻后用酶聯(lián)檢測儀檢測OD，進而測定其ALP。

1.2.6 對MSC中Ⅰ型膠原表達的影響 3%H2O2室溫孵育10 min，消除內源性過氧化物酶的活性，蒸餾水洗3次;滴加正常山羊血清封閉液，室溫20 min，甩去多余液體;滴加適當稀釋的一抗，37℃孵育2 h，PBS洗2 min×3次;滴加生物素化山羊抗兔IgG，20～37℃ 20 min PBS洗2 min×3次;滴加SABC試劑20～37℃ 20 min，PBS洗2 min×4次;使用DAB顯色試劑盒顯色:將試劑盒中A、B、C試劑各1滴加入1 m l蒸餾水中，混勻后滴加至爬片。室溫顯色，鏡下控制反應時間，蒸餾水洗滌;脫水，透明，封片，顯微鏡觀察染色結果并照相。

1.2.7 統(tǒng)計學方法 采用SPSS10.0軟件進行統(tǒng)計學處理，計量資料采用±s表示，組間比較采用t檢驗，以P≤0.05為有統(tǒng)計學差異。

2 結果

2.1 MSC形態(tài)學觀察 原代體外培養(yǎng)的犬MSC接種后的最初72 h，培養(yǎng)液中的細胞成分以不貼壁的單核細胞增多，隨培養(yǎng)時間延長，這些細胞逐漸壞死破碎或經過1～2次換液，已基本篩除。4 h開始貼壁，24 h有少數(shù)細胞貼壁，48 h后貼壁細胞明顯增多，并開始分裂增殖，細胞呈成纖維細胞梭形外觀。5～7 d，造血細胞成分已基本消失，貼壁細胞體積增大，多為梭形，帶有粗大突起，有些則為三角形或多角形，隨著貼壁細胞增多，形態(tài)變?yōu)殚L梭形，呈成纖維樣改變。原代生長較慢，常需10 d左右長滿瓶底，一旦開始傳代生長速度明顯加快，在培養(yǎng)瓶中均勻生長，漩渦樣匯合，緊密貼壁，呈草束狀排列。FS為半透明凝膠，通過倒置顯微鏡可以觀察到各組細胞與FS融合生長，難以區(qū)分。

2.2 對MSC增殖與分化的影響 見表1。

表1 實驗組和對照組MSC增殖與分化比較(±s)

表1 實驗組和對照組MSC增殖與分化比較(±s)

注:與對照組比較，*P ＜0.01

組別 MSC 增殖第1天 第3天 第5天活性第1天 第3天ALP對照組 0.07 ±0.02 1.02 ±0.07 2.05 ±0.12 0.26 ±0.03 0.30 ±0.09實驗組 0.08 ±0.01 1.03 ±0.11 2.05 ±0.11 0.27 ±0.01 0.43 ±0.12*

2.3 Ⅰ型膠原表達 正常MSC細胞質中有Ⅰ型膠原表達，但含量較低，而采用rhBMP-2微球作用后的MSC陽染顆粒增多，染色明顯。

3 討論

大多數(shù)研究認為BMP對細胞增殖的作用不明顯，但卻具有較強的誘導MSC向成骨細胞轉化的作用［5］，甚至有研究報道BMP抑制MSC細胞的增殖，并呈劑量依賴性［6］。本實驗結果亦顯示rhBMP-2/PLGA微球MSC增殖作用不明顯，可見rhBMP-2是一種強促分化劑，并不促進細胞的增殖。

rhBMP-2有促進未分化的間充質細胞、骨系細胞的募集和分化及誘導體外成骨的能力。無論是對于MSC還是原代胚胎大鼠顱骨成骨細胞，rhBMP-2都可促進體外成骨，即鈣結節(jié)的生成，增加成骨細胞標記酶—ALP的活性，以及促進標志骨細胞分化基因的表達，如促進I型膠原、ALP、骨鈣素和骨涎液蛋白的分泌及mRNA的表達。本實驗結果顯示，細胞ALP、I型膠原蛋白表達較對照組明顯升高，結合BMP體外釋放測定結果分析，說明釋放rhBMP-2仍保持其誘導成骨分化的活性。

綜上所述，我們所制備的rhBMP-2/PLGA微球具有良好的生物相容性，并可為MSC的生長提供良好的環(huán)境，能被用來作為細胞因子的載體或支架應用于臨床及實驗中。

［1］段宏，王光林，裴福興，等.堿性成纖維細胞生長因子緩釋微球對成骨細胞作用的實驗研究［J］.中華創(chuàng)傷雜志，2004，20(2):89-92.

［2］Holland TA，Tessmar JK，Tabata Y，etal.Transforminggrowth factor-beta 1 release from oligo(poly(ethylene glycol)fumarate)hydrogels in conditions thatmodel the cartilagewound healing environment［J］.JControl Release，2004，94(1):101-114.

［3］朱彗勇，吳求亮，申屠建，等.多孔聚乳酸—聚乙醇酸共聚物作為緩釋重組人骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2載體的實驗研究［J］.中華創(chuàng)傷雜志，2004，20(10):602-605.

［4］Lu L，Stamatas GN，Mikos AG.Controlled release of transforming growth factor betal from biodegradable polymermicroparticles［J］.J Biomed Mater Res，2000，50(3):440-451.

［5］Schrier JA，Deluca PP.Recombinant human bone morphogenetic protein-2 binding and incorporation in PLGA microsphere delivery systems［J］.Pharm Dev Technol，1999，4(4):611-621.

［6］Fromigue O，Marie PL，LomriA.Bonemorphogenetic protein-2 and transforming growth factor-beta-2 interact to human bone marrow stromal cell proliferation and differentiation［J］.JCell Biochem，1998，68(4):411-426.