趙 斌，楊 昱，詹勝鋒，彭 江，王 玉，趙 喆，任志午，張 莉，許文靜，盧世璧

(中國人民解放軍總醫(yī)院，北京100853)

化學(xué)去細(xì)胞同種異體神經(jīng)(CEAN)最大限度去除了免疫原性物質(zhì)，同時(shí)較完好地保存了神經(jīng)內(nèi)部結(jié)構(gòu)和細(xì)胞外基質(zhì)的活性成分，可作為自體神經(jīng)移植的替代材料。然而，前期研究［1，2］局限于單根單支周圍神經(jīng)的長度，對于復(fù)雜部位的周圍神經(jīng)缺損的修復(fù)，如具有叢狀結(jié)構(gòu)的臂叢神經(jīng)缺損、“一主干多分支”的神經(jīng)(如尺神經(jīng)手部分支、面神經(jīng))缺損，國內(nèi)外鮮有報(bào)道。本研究嘗試運(yùn)用化學(xué)萃取法處理大鼠全面神經(jīng)，修復(fù)大鼠全面神經(jīng)10 mm缺損，探討CEAN修復(fù)特殊部位周圍神經(jīng)缺損的效果。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及主要試劑、設(shè)備 成年SD大鼠40只，體質(zhì)量(250±20)g，由解放軍總醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。Triton X-100液、脫氧膽酸鈉、熒光金、快藍(lán)(美國Sigma公司)，愛德華牌TSJ-1A型自動(dòng)組織脫水機(jī)(天津天利航空機(jī)電公司)，BMJ-1型組織包埋機(jī)(天津天利航空機(jī)電公司)，Leitz 1516型組織切片機(jī)(德國Leica公司)，BH-2 OLYMPUS生物顯微鏡(日本OLYMPUS公司)。

1.2 化學(xué)去細(xì)胞同種異體面神經(jīng)制備 取5只SD大鼠，10%水合氯醛腹腔注射麻醉，無菌條件下取雙側(cè)面神經(jīng)，長約15 mm，去除神經(jīng)周圍外膜，采用0.4%脫氧膽酸鈉與0.3%Triton X-100處理坐骨神經(jīng)制備CEAN，60Co輻照1 h，置于2 ml PBS液(pH 7.4)4℃儲(chǔ)存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 自體面神經(jīng)凍融處理 在無菌條件下取5只SD大鼠雙側(cè)面神經(jīng)，將切斷的全面神經(jīng)放入裝有10%甘油凍存管，紗布包裹后放入液氮3 min，再將凍存管于37℃水浴3 min，取出面神經(jīng)，生理鹽水沖洗后4℃儲(chǔ)存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 面神經(jīng)缺損動(dòng)物模型制備及分組 取30只SD大鼠，10%水合氯醛腹腔注射麻醉，無菌條件下顯露左側(cè)面神經(jīng)主干及5個(gè)分支，近端切斷面神經(jīng)主干，從該斷點(diǎn)至各分支10 mm處切斷各分支，造成各分支10 mm的缺損。將大鼠隨機(jī)分為A、B、C 3組(n=10)，即自體全面神經(jīng)移植組(A組)、化學(xué)去細(xì)胞同種異體全面神經(jīng)移植(CEANA)組(B組)和自體全面神經(jīng)經(jīng)液氮凍融后回植組(C組)，各組分籠飼養(yǎng)。

1.5 觀測指標(biāo)

1.5.1 去細(xì)胞程度觀察 分別切取上述化學(xué)去細(xì)胞同種異體全面神經(jīng)、正常大鼠全面神經(jīng)和凍融處理后自體面神經(jīng)的主干及5個(gè)分支(顳支、顴支、頰支、下頜緣支、頸支)，各約2 mm。神經(jīng)標(biāo)本行橫向冰凍切片，片厚10μm。切片室溫放置30 min后入4℃丙酮固定10 min。PBS液洗5 min×3次。滴加Hochest-33258熒光染料，染色5 min。PBS液洗5 min×3次，甘油封片，熒光顯微鏡下觀察、比較神經(jīng)內(nèi)細(xì)胞的殘留情況及保留結(jié)構(gòu)程度。

1.5.2 術(shù)后一般情況和功能評價(jià) 觀察術(shù)后大鼠精神狀態(tài)、傷口情況、面部皮膚色澤、面部表情是否左右對稱、眼裂大小、觸須動(dòng)度等。

1.5.3 免疫熒光染色 術(shù)后12周，SD大鼠麻醉后取出左側(cè)面神經(jīng)，分別切取移植物的主干及5個(gè)分支末端2 mm的神經(jīng)組織，垂直于神經(jīng)軸向切片，片厚5μm，每段神經(jīng)切2張切片，對切片進(jìn)行神經(jīng)纖維細(xì)絲蛋白(NF200)和神經(jīng)生長因子受體(P75)的免疫熒光染色，切片室溫放置30 min，入4℃丙酮溶液固定10 min后，PBS液洗5 min×3次。3%H O孵育5～10 min。蒸餾水沖洗，PBS液浸泡5 min。滴加NF200鼠抗人一抗(1∶200)，4℃過夜。PBS液洗5 min×3次。滴加FITC(1∶100，綠色)標(biāo)記抗鼠IgG，避光40 min。PBS液洗5 min×3次。滴加P75兔抗人一抗(1∶200)，37℃ 1 h，PBS液洗5 min×3次。滴加TRITC(1∶100，紅色)標(biāo)記抗兔IgG稀釋，避光40 min。PBS液洗5 min×3次，封片，熒光顯微鏡下觀察神經(jīng)橫截面上神經(jīng)纖維和雪旺細(xì)胞的生長情況。

2 結(jié)果

2.1 CEAN大鼠全面神經(jīng)形態(tài)和組織學(xué)觀察 大體觀察可見化學(xué)去細(xì)胞同種異體全面神經(jīng)長度較之前縮短，外膜光滑，略通透，質(zhì)地較韌。Hochest-33258熒光染色后，可見萃取前新鮮大鼠面神經(jīng)內(nèi)有大量細(xì)胞存在，其細(xì)胞核被熒光染料染成藍(lán)色;而CEAN內(nèi)，藍(lán)色亮點(diǎn)幾乎不可見，即細(xì)胞去除干凈，CEAN結(jié)構(gòu)完整。而液氮凍融后面神經(jīng)內(nèi)可見大量細(xì)胞碎片，神經(jīng)結(jié)構(gòu)破壞嚴(yán)重。

2.2 術(shù)后一般情況和功能評價(jià) 術(shù)后3 d，各組大鼠精神狀態(tài)良好，傷口處稍紅腫，傷口干燥，無血性及膿性分泌物。靜息狀態(tài)下面部表情不對稱，鼻尖歪向健側(cè)(右側(cè));活動(dòng)狀態(tài)下術(shù)側(cè)(左側(cè))觸須動(dòng)度明顯弱于健側(cè)。且各組大鼠間無明顯差異。術(shù)后12周，靜息狀態(tài)下大鼠面部表情左右對稱，無明顯歪斜;活動(dòng)狀態(tài)下，兩側(cè)觸須動(dòng)度基本一致。

2.3 再生神經(jīng)的大體形態(tài) 術(shù)后12周取材，觀察到自體面神經(jīng)移植組神經(jīng)組織與周圍組織輕微粘連，有少量瘢痕形成;移植物及遠(yuǎn)、近段神經(jīng)呈正常外觀，白色較韌，有光澤，無萎縮;神經(jīng)吻合口無膨大，連續(xù)性良好。CEANA組和凍融組神經(jīng)組織與周圍組織粘連較重，但較易分離，少量瘢痕形成;吻合口處稍膨大，移植物與兩端受體神經(jīng)粗細(xì)一致，顏色相近，質(zhì)地較韌。

2.4 免疫熒光染色 NF200和P75免疫熒光染色可見3組移植的全面神經(jīng)其5個(gè)分支遠(yuǎn)端均有大量新生的神經(jīng)纖維和大量新生的梭形雪旺細(xì)胞，部分新生的神經(jīng)纖維周圍包繞新生的雪旺細(xì)胞。各組大鼠間無明顯差異。術(shù)后12周，A組、B組有髓神經(jīng)纖維總數(shù)均優(yōu)于C組(P＜0.05)，A組與B組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。見表1。

表1 術(shù)后12周各組大鼠面神經(jīng)各支有髓神經(jīng)纖維計(jì)數(shù)(±s)

表1 術(shù)后12周各組大鼠面神經(jīng)各支有髓神經(jīng)纖維計(jì)數(shù)(±s)

注:與 A 組比較，*P ＜0.05;與 B 組比較，△P ＜0.05

組別 主干 顳支 顴支 頰支 下頜緣 頸支A組 2 309±246 1 501±130 1 664±124 2 025±150 1 876±911 401±121 B組 2 223±224* 1 374±124* 1 651±113* 2 015±158* 1 769±131* 1 298±89*C組 2 031±179＊△ 1 363±158＊△ 1 554±87＊△ 1 862±159＊△ 1 757±137＊△ 1 303±72＊△

3 討論

對于特殊部位具有特殊結(jié)構(gòu)的周圍神經(jīng)，如面神經(jīng)“一主干五分支”結(jié)構(gòu)，難以找到自體能夠匹配的供體神經(jīng)，而異種神經(jīng)存在較強(qiáng)的排斥反應(yīng)。另外，目前利用組織工程的方法還無法做出“一主干五分支”且與缺損相匹配的結(jié)構(gòu)［3］。同種異體神經(jīng)的出現(xiàn)解決了以上難題，而且保留了神經(jīng)的獨(dú)特結(jié)構(gòu)，其天然的仿生性是其他任何移植替代材料所無法比擬的。

本研究結(jié)果顯示，CEANA結(jié)構(gòu)保存完整，而液氮凍融后結(jié)構(gòu)破壞嚴(yán)重。證實(shí)了凍融法雖然能殺死細(xì)胞、去除免疫原性，但不能清除細(xì)胞碎片，且引起基底膜碎裂。由于細(xì)胞碎片的存在，在修復(fù)過程中巨噬細(xì)胞和雪旺氏細(xì)胞侵入基底膜管進(jìn)行吞噬，這種細(xì)胞侵入在神經(jīng)再生的早期起阻礙作用，且進(jìn)一步破壞基底膜［4］。

化學(xué)萃取法主要是使用各種化學(xué)去污劑破壞掉雪旺細(xì)胞和髓鞘，并清除細(xì)胞碎片及髓鞘的殘留物，保留神經(jīng)外膜、束膜和內(nèi)膜形成的管柱狀結(jié)構(gòu)和雪旺細(xì)胞基底板層及其主要成分［5］，具有其他替代材料無法比擬的優(yōu)越性，成為修復(fù)周圍神經(jīng)缺損理想材料之一，體現(xiàn)出此種結(jié)構(gòu)的同種異體神經(jīng)的獨(dú)一無二性，其內(nèi)部天然的基底膜特殊結(jié)構(gòu)，比單根單支周圍神經(jīng)的基底膜結(jié)構(gòu)更為復(fù)雜，且在神經(jīng)損傷后再生的過程中，對于基底膜的完整性要求更高，而傳統(tǒng)的物理去除免疫原性方法，對單根單支周圍神經(jīng)的基底膜結(jié)構(gòu)破壞都很嚴(yán)重，更難達(dá)到此種特殊結(jié)構(gòu)周圍神經(jīng)的“高標(biāo)準(zhǔn)”，勢必遭到淘汰。

本研究中術(shù)后12周結(jié)果顯示，3組再生的面神經(jīng)均由主干沿著“一主干五分支”的特殊結(jié)構(gòu)順利通過10 mm的缺損，成功長入終末靶器官。且CEANA組再生有髓神經(jīng)纖維計(jì)數(shù)明顯優(yōu)于自體面神經(jīng)液氮凍融后回植組的修復(fù)效果。

總之，CEANA對于特殊部位具有特殊“一主干多分支”結(jié)構(gòu)的周圍神經(jīng)而言，是其他任何移植材料都無法比擬和替代的，在今后臨床復(fù)雜的周圍神經(jīng)損傷病例中，CEANA的優(yōu)越性將逐步體現(xiàn)，最終得到廣泛應(yīng)用。

［1］Yu H，Peng J，Guo Q，et al.Improvement of peripheral nerve regeneration in acellular nerve grafts with local released of nerve growth factor［J］.Microsurgery，2009，29(4):330-336.

［2］Li Z，Peng J，Wang G，et al.Effects of local release of hepatocyte growth factor on peripheral nerve regeneration in acellular nerve grafts［J］.Exp Neurol，2008，214(1):47-54.

［3］Hudson TW，Evans GR，Schmidt CE.Engineering strategies for peripheral nerve repair［J］.Orthop Clin North Am，2000，31(3):485-498.

［4］王冠軍，孫明學(xué)，盧世璧，等.改良化學(xué)去細(xì)胞同種異體神經(jīng)制備方法的實(shí)驗(yàn)研究［J］.中國矯形外科雜志，2007，15(12):929-932.

［5］孫明學(xué)，王鑫，趙斌，等.化學(xué)去細(xì)胞法對粗大神經(jīng)質(zhì)量評價(jià)方法及影響因素的探討［J］.中國修復(fù)重建外科雜志，2008，22(11):1373-1377.