劉泓基，彭 艷，廖 玲，薄曉通，苗蘇州

(1桂林醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院，廣西桂林 541001;2廣西師范大學(xué);3南京市第二人民醫(yī)院)

近年研究發(fā)現(xiàn)，脾酪氨酸激酶(Syk)表達缺失可能與乳腺癌、肝癌、胃癌、結(jié)直腸癌、胰腺癌、膽囊癌等形成和轉(zhuǎn)移有關(guān)，但鮮見 Syk蛋白在胃癌組織中表達的報道。2010年 9～12月，我們對 Syk蛋白與胃癌發(fā)生、發(fā)展及其惡性生物學(xué)行為的關(guān)系進行了相關(guān)研究?，F(xiàn)報告如下。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選擇在桂林醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院行手術(shù)治療且資料保存完整的 38例胃癌患者的病灶切除組織標本。其中，男 22例、女 16例，年齡 38～76歲，術(shù)前均未行放療、化療及生物制劑治療。根據(jù)2009年國際抗癌聯(lián)盟及美國腫瘤聯(lián)合會聯(lián)合制定的 TNM分期標準進行臨床分期，T1+T2期 16例、T3+T4期 22例。另隨機選擇癌旁組織(距瘤塊組織 5 cm以上)16例組織標本作為對照。

1.2 方法 濃縮型一抗購自美國 BG公司(型號:P04S066785E)，即用型二抗試劑盒購自中杉金橋(美國 GBI公司，型號:PV-9005)檢測 Syk蛋白表達。蠟塊 4μm連續(xù)切片，53℃孵育 60 min，切片常規(guī)脫蠟和水化后，先用 PBS沖洗 3次 ×3 min，再用檸檬酸鈉加熱法對抗原進行修復(fù)2 min。室溫下，切片置 3%過氧化氫中 10 min，PBS沖洗 3次;10%血清孵育 10 min，加一抗室溫下孵育 60 min，PBS沖洗3次 ×5 min;加中杉金橋二抗試劑按 1∶200稀釋孵育 10～15 min，PBS沖洗 3次;加新鮮配制二氨基聯(lián)苯溶液顯色，顯微鏡下觀察 1～3 min。自來水沖洗后加入蘇木素復(fù)染，再用 PBS沖洗返藍。切片經(jīng)梯度乙醇脫水干燥，二甲苯透明，中性樹膠封片，顯微鏡下觀察、照相。每批染色均設(shè)陰性空白對照，以PBS代替一抗作陰性對照，用人 Burkitt淋巴瘤細胞作陽性對照。結(jié)果判斷:以細胞質(zhì)中出現(xiàn)棕黃色顆粒為陽性，每例切片至少計數(shù) 10個 400倍視野，細胞數(shù)所占比例分為:＜10%(-)，10%～29%(+)，30%～50%(++)，＞50%(+++)。染色強度判定:不著色 (-)，淺棕黃色 (+)，棕黃色 (++)，棕褐色(+++)。綜合陽性細胞數(shù)和染色強度對染色結(jié)果進行分析。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法 采用 SPSS17.0統(tǒng)計軟件，計數(shù)資料比較采用 χ2檢驗，計量資料比較采用 t檢驗。P≤0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 Syk蛋白在胃癌及癌旁組織的表達情況 胃癌及癌旁組織中 Syk蛋白陽性分別為 8例(21.05%)、14例(87.50%)，兩者比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=20.59，P＜0.01)。

2.2 Syk蛋白在胃癌組織的表達與臨床病理參數(shù)的關(guān)系 見表1。

3 討論

Syk基因最早由日本學(xué)者 1991年從豬脾 cDNA克隆出來的，該基因位于人類染色體 9q22，分子量72 kD，由 629個氨基酸組成。Syk是目前發(fā)現(xiàn)的唯一有抑癌作用的蛋白酪氨酸激酶。Coopman等首先發(fā)現(xiàn)乳腺癌細胞中有 Syk表達缺失現(xiàn)象，此后大量研究表明，在多種腫瘤發(fā)病過程中存在 Syk表達缺失現(xiàn)象[1～4]。

表1 Syk蛋白的表達與胃癌臨床病理參數(shù)的關(guān)系

目前認為 Syk可能通過以下機制影響腫瘤發(fā)生:影響細胞遷移;抑制細胞分裂和增殖;干預(yù)某些細胞因子的分泌;抑制腫瘤成瘤能力和轉(zhuǎn)移。胡青鋼等[5]發(fā)現(xiàn)，Syk的表達與胃癌的微血管密度呈明顯的負相關(guān)，提示 Syk作為一種候選抑癌基因，可能通過影響血管的生成而抑制腫瘤生長和轉(zhuǎn)移。Carter等[6]研究證實，Syk可通過抑制腫瘤細胞分泌腫瘤相關(guān)細胞因子抑制腫瘤的生長與轉(zhuǎn)移。劉月仙等[7]研究發(fā)現(xiàn)，有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的胃癌組織 Syk基因甲基化率顯著高于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組，表明 Syk基因的甲基化與胃癌生成及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)[8]。Wang等[9]研究發(fā)現(xiàn) Syk基因甲基化導(dǎo)致在胃癌中存在Syk基因失表達現(xiàn)象，表明 Syk啟動子甲基化與胃癌形成和轉(zhuǎn)移有關(guān)。

Syk基因在胃癌中的表達報道不一致，有文獻報道 Syk在胃癌中表達陽性率為 5.1%～41.2%，本研究結(jié)果與文獻報道一致。本研究表明，Syk蛋白在胃癌組織中的表達強度明顯低于正常癌旁組織(P＜0.01)，且在腫瘤組織中 Syk蛋白表達強度與漿膜浸潤、TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及遠處轉(zhuǎn)移等有密切關(guān)系(P＜0.05)，而與年齡、性別、組織學(xué)類型無關(guān)。大量研究表明，Syk有抑制腫瘤發(fā)生和轉(zhuǎn)移的功能。在本課題的后續(xù)研究中，在擴大樣本量的基礎(chǔ)上，應(yīng)用熒光定量 PCR和甲基化 PCR法在基因水平檢測 Syk表達與胃癌惡性生物學(xué)行為的關(guān)系，并應(yīng)用 FISH檢測 Syk基因擴增和基因突變情況，進一步探索胃癌中 Syk失表達的機制，并聯(lián)合檢測 HER-2及 EGFR基因，從分子和細胞生物學(xué)角度探討多基因與胃癌發(fā)生及轉(zhuǎn)移的關(guān)系，為進一步尋找胃癌早期診斷的分子生物標志及早期分子治療的靶標提供實驗依據(jù)和理論依據(jù)。

總之，Syk蛋白在胃癌組織中呈現(xiàn)明顯表達缺失，且與其漿膜浸潤、TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及遠處轉(zhuǎn)移傾向相關(guān)。Syk在胃癌的發(fā)生、發(fā)展及其防治中的作用機制有待進一步研究。

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