邢曉靜 ，谷小虎，趙 巖，椰慧楠，鄭洪新

(1遼寧省腫瘤醫(yī)院，沈陽110042;2遼寧中醫(yī)藥大學(xué))

中醫(yī)理論認(rèn)為，健脾益氣為胃癌的基本治則［1］。2010年6～12月，我們采用血清藥理學(xué)方法，觀察健脾益氣方含藥血清對人胃癌細(xì)胞株MKN-28凋亡的影響。

1 材料與方法

1.1 主要實(shí)驗(yàn)材料 人胃癌細(xì)胞株MKN-28(購自上海細(xì)胞庫)。高糖DMEM培養(yǎng)基(Thermo Fisher公司)，胎牛血清(Hyclone公司)，Hoechst染色試劑盒、細(xì)胞周期與細(xì)胞凋亡檢測試劑盒(碧云天生物公司)，MTT(Sigma公司)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) MKN-28培養(yǎng)于含10%胎牛血清的高糖DMEM培養(yǎng)基中，在37℃、5%CO2、飽和濕度條件下的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，細(xì)胞貼壁生長。每2～3 d傳代1次，選用對數(shù)生長期細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.2.2 健脾益氣方含藥血清制備 用水煎法提取健脾益氣方藥物成分(參照張奮:碩士學(xué)論文2008，化痰散結(jié)中藥甲腫消對甲狀腺細(xì)胞凋亡影響的實(shí)驗(yàn)研究中的方法)，過濾、濃縮、得生藥浸膏劑。取空腹(禁食12 h)的雄性Wistar大鼠16只，隨機(jī)分為兩組:中藥組10只，按成人(65 kg體質(zhì)量)藥物劑量的10倍量灌胃，2 ml/次、2次/d、連續(xù)7 d;無藥組6只，生理鹽水灌胃，2 ml/次、2次/d、連續(xù)7 d。兩組無在末次灌胃1 h后，股動脈采血，放置2 h促凝，1 500 r/min離心10 min，收集上清(分別為含藥和無藥血清)，過濾，－80℃冷凍保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 細(xì)胞分組及細(xì)胞增殖抑制率測算 取MKN-28(5 000/孔)，分別加入2.5%、5.0%、7.5%、10.0%含藥血清培養(yǎng)(含藥組)，添加胎牛血清使培養(yǎng)體系總血清比例為10%;以加入無藥血清的細(xì)胞為對照(對照組)，所加大鼠血清濃度梯度與含藥組等同;以加入正常培養(yǎng)基培養(yǎng)的細(xì)胞為空白組，分別在培養(yǎng)24、48、72 h時(shí)，采用MTT法檢測波長為490 nm處的OD值，計(jì)算細(xì)胞增殖抑制率。細(xì)胞增殖抑制率(%)=(空白組OD值－實(shí)驗(yàn)組OD值)/空白組OD值×100%。含藥組、對照組均為實(shí)驗(yàn)組。

1.2.4 細(xì)胞形態(tài)觀察 將MKN-28接種于含蓋玻片細(xì)胞培養(yǎng)板中，分別加入 5.0%、7.5%、10.0% 的含藥血清，48 h后行Hoechst33258染色，共聚焦顯微鏡下觀察各組細(xì)胞形態(tài)、熒光強(qiáng)度、細(xì)胞核形態(tài)。對照組同理。

1.2.5 細(xì)胞周期測定 取MKN-28 1×105個(gè)接種至細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，分別加入 5.0%、7.5%、10.0% 的含藥血清，48 h后，采用流式細(xì)胞術(shù)測定細(xì)胞周期。對照組同理。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS10.0統(tǒng)計(jì)軟件，抑制率及細(xì)胞周期比較采用t檢驗(yàn)，相關(guān)性分析采用一元回歸分析法。P≤0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 不同濃度含藥血清對MKN-28增殖抑制率的比較 見表1。含藥組MKN-28增殖抑制率與作用時(shí)間(R2分別為 0.912、0.897、0.995)和血清濃度梯度(R2分別為 0.996、0.973、0.972、0.978)呈正相關(guān)(P 均 ＜0.05)。

表1 加入不同濃度血清培養(yǎng)24、48、72 h時(shí)兩組MKN-28增殖抑制率比較(%，±s)

表1 加入不同濃度血清培養(yǎng)24、48、72 h時(shí)兩組MKN-28增殖抑制率比較(%，±s)

注:與對照組相同時(shí)點(diǎn)、血清濃度比較，*P＜0.05，△P＜0.01;與同組相同時(shí)點(diǎn)、高一血清濃度比較，#P＜0.05，▲P＜0.01;與同組相同濃度、前一時(shí)點(diǎn)比較，●P ＜0.05，□P ＜0.01

組別 MKN-28增殖抑制率24 h 48 h 72 h對照組2.5% 0.00 ±5.18 3.87 ±7.10 15.77 ±4.65 5.0% 0.83 ±3.79 3.85 ±9.40 20.84 ±1.62 7.5% 3.31 ±2.96 7.55 ±9.00 19.44 ±6.51 10.0% 8.73 ±9.56 12.89 ±6.43 25.03 ±4.49含藥組2.5% 3.12 ±2.99 14.73 ±8.29●□ 28.99 ±3.42△▲□5.0% 3.69 ±4.42# 17.67 ±4.87*#●□ 42.98 ±3.45△▲□7.5% 15.25 ±3.69△ 29.52 ±3.47△▲●□ 55.59 ±2.70△▲□10.0% 24.09 ±7.95▲ 50.37 ±4.10△▲●□ 65.84 ±3.46△▲□

2.2 細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察 含藥組細(xì)胞染色呈強(qiáng)藍(lán)色熒光，經(jīng)5%含藥血清處理后，細(xì)胞核出現(xiàn)濃縮現(xiàn)象，表現(xiàn)為著色較深;經(jīng)7.5%含藥血清處理后，細(xì)胞核濃縮加劇，呈現(xiàn)致密濃染;10.0%含藥血清處理后，細(xì)胞核呈碎塊狀致密濃染。對照組細(xì)胞染色呈微弱熒光，細(xì)胞核完整。

2.3 細(xì)胞周期檢測 含藥組四倍體期細(xì)胞所占比例下降。詳見表2。

表2 加入不同濃度血清培養(yǎng)48 h兩組MKN-28細(xì)胞周期比較(±s)

表2 加入不同濃度血清培養(yǎng)48 h兩組MKN-28細(xì)胞周期比較(±s)

注:與對照組相同血清濃度比較，*P ＜0.05，＊＊P ＜0.01;與同組高一血清濃度比較，#P＜0.05

組別 二倍體期(%) 四倍體期(%)對照組5.0% 61.71 ±2.91 38.29 ±2.91 7.5% 61.71 ±1.70 38.29 ±1.70 10.0% 64.06 ±1.63 35.94 ±1.63含藥組5.0% 65.02 ±1.20*# 34.98 ±1.20*#7.5% 68.34 ±1.15＊＊ 31.66 ±1.15＊＊10.0% 69.87 ±1.99＊＊ 30.13 ±1.99＊＊

3 討論

胃癌發(fā)病原因尚不清楚，多數(shù)病例確診時(shí)已屬中晚期，療效欠佳［2］。研究證實(shí)，某些中藥有效成分如大蒜素、苦參堿、白藜蘆醇等對胃癌細(xì)胞具有增殖抑制作用，并可誘導(dǎo)胃癌細(xì)胞發(fā)生凋亡［3］。

健脾益氣方由茯苓、木香、蜈蚣、陳皮、當(dāng)歸等組成。已有研究證實(shí)，茯苓對提高腫瘤患者的T淋巴細(xì)胞活性，特別是CD4+/CD8+具有較明顯的效果［4］;木香中的木香倍半萜則對人肺癌細(xì)胞株A549、胃癌細(xì)胞株SGC-7901和白血病細(xì)胞株K562、HL-60等有增殖抑制作用［5］;蜈蚣中含有類組胺物質(zhì)，對胃癌細(xì)胞、肝癌細(xì)胞具有抑制作用［6］。本研究采用血清藥理學(xué)方法觀察健脾益氣方含藥血清對胃癌細(xì)胞的作用，可避免中藥粗提物直接加入反應(yīng)體系中，提高實(shí)驗(yàn)結(jié)果的可信度。

本研究結(jié)果顯示，健脾益氣方含藥血清對MKN-28存在增殖抑制作用，且與含藥血清濃度和作用時(shí)間呈梯度依賴性。經(jīng)含藥血清處理后，MKN-28出現(xiàn)細(xì)胞核濃縮現(xiàn)象，呈致密濃染;四倍體期細(xì)胞所占比例下降，且高濃度含藥血清比低濃度含藥血清的細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)效應(yīng)明顯增強(qiáng)，說明健脾益氣方含藥血清具有誘導(dǎo)MKN-28細(xì)胞凋亡的作用。

［1］王玉，章永紅.胃癌的中醫(yī)研究進(jìn)展［J］.長春中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào)，2009，25(5):791-792.

［2］張玉超，申虎，雷海龍，等.胃癌治療的研究進(jìn)展［J］.中外醫(yī)療，2010，29(14):191-192.

［3］王艷艷，王威，李紅巖.中藥有效成分抗胃癌作用研究進(jìn)展［J］.中國藥房，2007，18(30):2383-2385.

［4］許小娟.參苓白術(shù)散治療消化系統(tǒng)惡性腫瘤術(shù)后胃腸功能紊亂58例［J］.吉林中醫(yī)藥，2006，26(1):21.

［5］王潞，趙烽，何恩其，等.18種木香倍半萜對6種人源腫瘤細(xì)胞增殖的影響［J］.天然產(chǎn)物研究與開發(fā)，2008，20(5):808-812.

［6］曲愛兵，趙維城，梁良，等.蜈蚣組織提取物抗腫瘤活性的初步研究［J］.實(shí)用腫瘤學(xué)雜志，2003，17(1):29-30.