費(fèi)超，孟蕾，劉子沐，張海鳴，杜樹山#（.北京師范大學(xué)資源學(xué)院教育部資源藥物工程研究中心，北京市 00875；.北京師范大學(xué)校醫(yī)院，北京市 00875）

丹夏乳癖片是由丹參、夏枯草、柴胡、雞血藤、橘葉、香附、白芍、桃仁、紅花等組成的純中藥制劑，具有活血化瘀散結(jié)、行氣止痛之功效，用于治療肝氣郁結(jié)、氣滯血瘀之乳腺增生、乳腺脹痛等。丹參為本方中君藥，丹參素是該藥的主要有效成分，故筆者以丹參素為指標(biāo)，參照2005年版《中國藥典》（一部）[1]方法，建立了丹夏乳癖片中丹參素的高效液相色譜（HPLC）含量測定方法。該方法快速、簡便、準(zhǔn)確、重復(fù)性好、結(jié)果可靠，可用于丹夏乳癖片的質(zhì)量控制。

1 儀器與試藥

Waters 1525 HPLC儀、Waters 2487紫外檢測器、Mellennium32色譜工作站（美國Waters公司）；KQ250型超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；AG135十萬分之一電子分析天平（瑞士Mettler Toledo公司）。

丹參素鈉對照品（中國藥品生物制品檢定所，批號：855-200202，供含量測定用）；丹夏乳癖片（北京師范大學(xué)資源學(xué)院教育部資源藥物工程研究中心自制，批號：20061011、20061013、20061015）；甲醇為色譜純，水為純凈水，其他試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱：Diamonsil C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相：甲醇-0.1%磷酸水溶液（10∶90）；檢測波長：280 nm；流速：1.0 mL·min-1；柱溫：30 ℃；進(jìn)樣量：10 μL。

2.2 溶液的制備

2.2.1 對照品溶液 精密稱取丹參素鈉對照品2.43 mg，置10 mL量瓶中，加50%甲醇溶解并定容，搖勻，濾過，即得（每1 mL含丹參素0.2187 mg）。

2.2.2 供試品溶液 取本品適量，研細(xì)，取粉末約1.5 g，精密稱定，置100 mL錐形瓶中，加入50%甲醇25 mL，稱重，超聲處理40 min（功率：250 W，頻率：40 kHz），取出，放至室溫，再稱重，50%甲醇補(bǔ)足失重，搖勻，濾過，即得。

2.2.3 陰性對照溶液 按丹夏乳癖片制備工藝制得缺丹參的陰性樣品，再按“2.2.2”項(xiàng)下方法制得陰性對照溶液。

2.3 線性關(guān)系考察

分別精密吸取對照品溶液（0.2187 mg·mL-1）2、4、7、10、13、15 μL，在上述色譜條件下分別注入液相色譜儀測定。以丹參素對照品的進(jìn)樣量（X）為橫坐標(biāo)，峰面積積分值（Y）為縱坐標(biāo)，進(jìn)行線性回歸，得回歸方程為Y＝629811X－90885（r＝0.9999，n＝6）。結(jié)果表明，丹參素進(jìn)樣量在0.49～3.64 μg范圍內(nèi)與峰面積積分值呈良好的線性關(guān)系。

2.4 專屬性試驗(yàn)

吸取對照品溶液、供試品溶液與陰性對照溶液各10 μL，分別注入液相色譜儀，按上述方法進(jìn)行測定。結(jié)果表明，對照品與供試品溶液中丹參素的保留時間基本一致，陰性對照溶液在丹參素色譜峰位置處無相應(yīng)的峰出現(xiàn)，說明制劑中其他成分對丹參素的測定不產(chǎn)生干擾。色譜見圖1。

圖1 高效液相色譜圖A.對照品；B.供試品；C.陰性對照；1.丹參素鈉Fig 1 HPLC chromatogramsA.substance control；B.sample；C.negative control；1.sodium danshensu

2.5 精密度試驗(yàn)

精密吸取對照品溶液10 μL，重復(fù)進(jìn)樣6次，測定丹參素峰面積。結(jié)果，RSD＝0.96%（n＝6），表明儀器精密度良好。

2.6 穩(wěn)定性試驗(yàn)

精密吸取同一供試品溶液（批號：20061011）適量，分別于0、2、4、6、8、12 h進(jìn)樣測定，記錄峰面積。結(jié)果，RSD＝0.39%（n＝6），表明供試品溶液在12 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.7 重復(fù)性試驗(yàn)

精密稱取同一批丹夏乳癖片（批號：20061011）適量，共6份，分別按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，并在上述色譜條件下進(jìn)行測定。結(jié)果，樣品中丹參素平均含量的RSD＝2.46%（n＝6），表明方法重復(fù)性良好。

2.8 加樣回收率試驗(yàn)

取已知準(zhǔn)確含量的樣品（批號：20061011）0.75 g，精密稱定6份，置100 mL量瓶中，分別精密加入對照品溶液（相當(dāng)于含丹參素2.268 mg·mL-1）1 mL，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，進(jìn)樣10 μL，在上述色譜條件下測定，計(jì)算加樣回收率，結(jié)果見表1。

表1 加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果（n＝6）Tab 1 Results of recovery tests（n＝6）

2.9 樣品含量測定

在上述色譜條件下，分別精密吸取供試品溶液與對照品溶液各10 μL，注入液相色譜儀，記錄峰面積，計(jì)算3批9個樣品中丹參素的含量，結(jié)果見表2。

表2 樣品含量測定結(jié)果（n＝3）Tab 2 Results of content determination of samples（n＝3）

由表2可知，3批樣品中丹參素的平均含量為每片1.33 mg，故暫定為成品中每片含丹參素不少于1.06 mg。

3 討論

3.1 提取時間的考察

本試驗(yàn)采用超聲處理的方法，考察了不同提取時間（30、40、50、60 min）對含量測定的影響。結(jié)果表明，超聲提取40 min丹參素已提取完全。

3.2 檢測波長的確定

經(jīng)二極管陣列檢測器在180～400 nm波長范圍內(nèi)掃描，可得丹參素紫外掃描分別在282.8 nm和224.8 nm波長處有吸收，但考慮到在測定過程中使用甲醇作為流動相，而甲醇在低波長處有紫外吸收，因此檢測波長選擇為280 nm。

3.3 流動相的選擇

根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道[2～5]，選用甲醇-0.1%磷酸水溶液（10∶90）為流動相對本品進(jìn)行試驗(yàn)，色譜柱為Diamonsil C18（250 mm×4.6 mm，5 μm），所得色譜圖的分離度好、保留時間合適。將該條件下的色譜圖記錄下來，以被測組分丹參素鈉峰計(jì)算理論板數(shù)為7114，丹參素鈉峰與相鄰峰的分離度為10。根據(jù)試驗(yàn)結(jié)果，結(jié)合考慮儀器、色譜柱、流動相的配制和溫度等系統(tǒng)因素的影響，規(guī)定理論板數(shù)按丹參素鈉峰計(jì)算應(yīng)不低于2000。

[1]國家藥典委員會編.中華人民共和國藥典（一部）[S].2005年版.北京：化學(xué)工業(yè)出版社，2005：52.

[2]潘 見，周蓓蓓，開桂青，等.丹參中丹參素的含量測定[J].食品科學(xué)，2007，28（8）：348.

[3]鄒藹珍.樂脈顆粒的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究[J].中國藥房，2005，16（15）：1177.

[4]李 慶，王 東.活血膠囊中丹參素和原兒茶醛的含量測定[J].中國中醫(yī)藥信息雜志，2007，14（4）：52.

[5]陶金成，錢文璟，宋少剛，等.不同廠家復(fù)方丹參注射液質(zhì)量考察[J].中國藥房，2005，16（12）：937.