朱寶英,趙立波,王茜,張春燕,陳欣,黃靜,方翼#b(1.貴陽醫(yī)學(xué)院,貴陽市 550004;.北京大學(xué)人民醫(yī)院,北京市 100044)
氯法拉濱是第2代嘌呤核苷酸類似物[1],可用于治療兒童難治性或復(fù)發(fā)性急性淋巴細(xì)胞白血病(ALL)[2,3]。其作為一種新型的抗癌藥,既能抑制脫氧核糖核酸(DNA)聚合酶,使DNA合成終止,又能抑制核苷酸還原酶,從而終止DNA鏈的延長及修復(fù)。該藥于2005年1月在美國上市,對急性白血病尤其有效,作為近10年來首個獲準(zhǔn)專門用于治療兒童白血病的新藥,主要用于治療兒童難治性或復(fù)發(fā)性ALL,是目前唯一專門用于兒童急性白血病的化療藥[4],國內(nèi)尚無相關(guān)制劑上市。目前有關(guān)氯法拉濱血藥濃度的測定方法,國外報道不多[5~7],國內(nèi)也僅見1篇報道[8]。本研究旨在應(yīng)用近年來迅速發(fā)展的高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜電噴霧(HPLC-MS/MS)檢測技術(shù),建立一種簡便、靈敏、快速、準(zhǔn)確的人血漿中氯法拉濱濃度的定量分析方法,以滿足氯法拉濱藥動學(xué)研究的需要。
1200型高效液相色譜包儀,包括G1312A型二元輸液泵、G1329A型自動進(jìn)樣器、G1316A型柱溫箱、G1379B型脫氣機(jī)(美國Agilent公司);AB SCIEX QTRAP5500型三重四極桿線性離子阱串聯(lián)質(zhì)譜儀,配備電噴霧電離源(Turbo Ionspray)、Analyst1.5.1分析軟件(美國Applied Biosystems公司);Vortex-2 GENIE渦旋混合器(美國Scientific Industrics公司);MD 200 Sample concentiator型氮吹儀(北京晨曦科創(chuàng)科技發(fā)展公司);Anketdl-40B型普通離心機(jī)(上海安亭科學(xué)儀器廠);Ministart plus型微型高速離心機(jī)(杭州奧盛儀器有限公司);KH-600E型超聲波清洗器(昆山禾創(chuàng)超聲儀器有限公司);GM-50(天津騰達(dá)過濾器件廠);CPA225D型萬分之一天平(德國Sartorius公司)。
氯法拉濱對照品(批號:20100709)、克拉屈濱對照品(內(nèi)標(biāo),批號:AP-010-B101202)、噴司他汀對照品(穩(wěn)定劑)均為浙江貝達(dá)藥業(yè)有限公司提供;乙腈、甲醇、甲基叔丁基醚、甲酸、乙酸銨為色譜純,水為Direct-Q?超純水系統(tǒng)(美國Millipore公司)自制。
色譜柱:Thermo C18柱(150 mm × 4.6 mm,5 μm);流動相:乙腈-水(250∶3,其中含4 mmol·L-1的乙酸銨和0.3% 的甲酸);流速:0.5 mL·min-1;進(jìn)樣量:10 μL;每個樣品的分析時間:5 min。
電噴霧離子源:正離子掃描;噴霧口位置:3∶5;Gas 1:35.0 Psi;Gas 2:70.0 Psi;氣簾氣壓力:35.0 Psi;碰撞氣壓力:Medium;離子源電壓:4500.0 V;離子源溫度:600℃;多離子反應(yīng)監(jiān)測(MRM)掃描分析,用于定量氯法拉濱和克拉屈濱的離子反應(yīng)分別為m/z 304.2→170.0,m/z 286.1→170.0。
在該色譜及質(zhì)譜條件下,考察6個來自不同個體的質(zhì)譜圖,空白血漿、對照品加入到空白血漿中和受試者服藥后的血漿樣品色譜圖見圖1。
2.2.1 氯法拉濱工作溶液:準(zhǔn)確稱取氯法拉濱對照品適量,加入少量甲醇溶解并定容,配成濃度為1 mg·mL-1的貯備液1,并從中取出少量稀釋并定容,配成濃度為100 μg·mL-1的貯備液2。將貯備液2用流動相稀釋成系列工作溶液供分析用。
圖1 液-質(zhì)圖譜A.質(zhì)譜圖;B.空白血漿;C.對照品+空白血漿;D.受試者服藥后的血漿樣品Fig 1 HPLC-MS/MSA.MS;B.blank plasma;C.standard control+blank plasma;D.blood sample of patients
2.2.2 內(nèi)標(biāo)溶液:準(zhǔn)確稱取內(nèi)標(biāo)克拉屈濱對照品適量,用甲醇溶解并定容,配成濃度為1 mg·mL-1的貯備液3,并從中取出少量用甲醇稀釋并定容,配成濃度為100 μg·mL-1的貯備液4。從貯備液4中取適量,用流動相稀釋成濃度為1 μg·mL-1的內(nèi)標(biāo)溶液。
將以上所有溶液置于4℃冰箱保存待用。
精密量取含噴司他汀10 μmol·L-1的空白血漿200 μL,置于7.0 mL塑料離心管中,加入內(nèi)標(biāo)溶液(1 μg·mL-1克拉屈濱)渦旋混勻1 min,然后加入提取劑甲基叔丁基醚3.0 mL,渦旋混勻10 min,4000 r·min-1離心5 min 后,取上清液2.6 mL,40 ℃氮氣吹干,加入流動相200 μL 復(fù)溶,渦旋混勻3 min,13400 r·min-1離心5 min 后,取上清液10 μL 進(jìn)樣分析。
取含噴司他汀10 μmol·L-1的空白血漿200 μL,分別加入不同濃度的氯法拉濱工作溶液20 μL,使血漿中氯法拉濱濃度分別為2.5、5、10、20、50、100、200、500 ng·mL-1,所有樣品按“2.3”項下方法操作,記錄色譜。以氯法拉濱與內(nèi)標(biāo)峰面積比(Y)對氯法拉濱濃度(X)進(jìn)行線性回歸,得到回歸方程Y=0.0138X-0.000545(r=0.9999),權(quán)重因子W=1/X2。結(jié)果表明,氯法拉濱血藥濃度在2.5~500 ng·mL-1范圍內(nèi)線性關(guān)系良好,最低定量限為2.5 ng·mL-1。
分別配制濃度為5、50、200 ng·mL-1的血漿樣品各5份,按“2.3”項下方法處理樣品,進(jìn)樣分析,考察氯法拉濱日內(nèi)精密度及方法回收率;連續(xù)測定3 d,考察日間精密度。方法回收率及精密度試驗結(jié)果見表1。
表1 回收率及精密度試驗結(jié)果(±s ,n=5)Tab 1 Results of recovery and precision tests(±s ,n=5)
表1 回收率及精密度試驗結(jié)果(±s ,n=5)Tab 1 Results of recovery and precision tests(±s ,n=5)
加入量/ng·mL-1 550200日間RSD/%4.0913.9411.07測得量/ng·mL-1 4.77±0.2649.09±3.29197.00±13.19方法回收率/%95.6498.8399.23日內(nèi)RSD/%4.774.475.64
取含噴司他汀的空白血漿200 μL于離心管內(nèi),按“2.4”項下方法處理,氮氣吹干后,分別用濃度為 5、50、200 ng·mL-1的氯法拉濱標(biāo)準(zhǔn)溶液200 μL復(fù)溶,每個濃度配置5份樣品,取10 μL進(jìn)樣分析,以得到色譜峰面積A與同樣濃度的氯法拉濱標(biāo)準(zhǔn)溶液直接進(jìn)樣獲得的色譜峰面積B的比值,考察基質(zhì)效應(yīng)。另分別配制濃度為5、50、200 ng·mL-1的血漿樣品各5份,按“2.3”項下方法處理樣品,進(jìn)樣分析得到血漿樣品中氯法拉濱的峰面積C,C/A×100%即為提取回收率。結(jié)果表明,氯法拉濱低、中、高3種濃度的基質(zhì)影響的RSD分別為9.93%、5.76%、11.38%??梢?,該方法基質(zhì)效應(yīng)小,具有特異、專一地測定分析物質(zhì)的能力。氯法拉濱低、中、高3種濃度提取回收率分別為81.79%、66.03%、77.40%,相應(yīng)的RSD分別為12.02%、5.75%、4.80%。
配制濃度為5、50、200 ng·mL-1的血漿樣品各3份,分別將處理前、后的2批樣品置于室溫下放置24 h,將另一批樣品反復(fù)凍融3次后,均按“2.3”項下方法處理,進(jìn)樣分析,當(dāng)日隨行雙標(biāo)準(zhǔn)曲線,考察樣品穩(wěn)定性。樣品穩(wěn)定性結(jié)果見表2。
表2 樣品穩(wěn)定性考察結(jié)果(n=3)Tab 2 Results of stability tests of samples(n=3)
測定了3位靜脈滴注氯法拉濱(52 mg·m-2·d-1)2 h的白血病患者(已簽署知情同意書)給藥前及給藥后不同時間點的血藥濃度。1名白血病患者注射氯法拉濱后的藥-時曲線見圖2。
圖2 1名白血病患者注射氯法拉濱后的藥-時曲線Fig 2 Plasma concentration-time curve of clofarabine in a leukemia patient after the injection of clofarabine
據(jù)外文文獻(xiàn)報道[6],樣品處理的方法采用乙腈沉淀蛋白法,考慮到沉淀法處理的樣品雜質(zhì)較多,故本試驗采用液液提取法處理樣品。另外文獻(xiàn)報道[8]采用乙酸乙酯提取法處理血漿,本試驗則比較了乙酸乙酯、乙醚和甲基叔丁基醚3種溶劑分別作為提取劑的提取效果,結(jié)果甲基叔丁基醚整體效果較好,故選用甲基叔丁基醚提取法處理血漿。因此,本試驗參考文獻(xiàn)[8]所定線性范圍為2.5~500 ng·mL-1,使檢測結(jié)果更靈敏、準(zhǔn)確。
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