譚瑞，楊俊卿，顏波，尚京川，黃愛龍（1.重慶醫(yī)科大學(xué)藥理學(xué)教研室，重慶市 400016；.重慶醫(yī)科大學(xué)藥物分析教研室，重慶市 400016；.重慶醫(yī)科大學(xué)感染性疾病分子生物學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，重慶市 400016）

替諾福韋富馬酸酯（Tenofovir disoproxil fumarate，TDF）是由美國(guó)吉利德公司研究開發(fā)的一種新型的核苷類逆轉(zhuǎn)錄酶抑制劑，2001年首次在美國(guó)上市，臨床主要用于治療人類免疫缺陷病毒（HIV）感染[1]，并與另一個(gè)抗逆轉(zhuǎn)錄病毒藥物恩曲他濱（Emtricitabine，F(xiàn)TC）作為治療HIV感染的一線藥物[2]。TDF還具有很好的抗乙型肝炎病毒（HBV）活性，美國(guó)食品與藥物管理局（FDA）已經(jīng)批準(zhǔn)其用于治療成人慢性乙型肝炎[3，4]。TDF已在國(guó)內(nèi)上市，F(xiàn)TC已在國(guó)內(nèi)生產(chǎn)，均作為抗艾滋病的二線藥物。并且目前國(guó)內(nèi)、外正在進(jìn)行TDF、TDF聯(lián)用FTC作為HIV暴露前預(yù)防用藥減少新發(fā)HIV感染的研究[5～7]中。國(guó)外已有關(guān)于TDF的藥動(dòng)學(xué)特征的報(bào)道[5]，而在中國(guó)人群，僅有1項(xiàng)健康人群TDF單獨(dú)給藥的藥動(dòng)學(xué)研究[8]。本文對(duì)TDF在中國(guó)西部健康人群中的藥動(dòng)學(xué)特征進(jìn)行了研究，并觀察高脂飲食以及合用FTC對(duì)TDF藥動(dòng)學(xué)參數(shù)的影響。

1 材料

1.1 儀器

1100型高效液相系統(tǒng)，包括G1311A型四元輸液泵、G1328B型自動(dòng)進(jìn)樣器、G1314A紫外檢測(cè)儀、G1316A型柱溫箱和G1322A型脫氣機(jī)（美國(guó)Agilent公司）；BS210S電子天平（德國(guó)賽多利斯公司）；Bond Elut C18固相萃取柱（200 mg/3 mL，美國(guó)瓦力安公司）。

1.2 試藥

TDF片（美國(guó)吉利德公司，規(guī)格：每片300 mg，批號(hào)：A708846）；FTC膠囊（河北醫(yī)科大學(xué)制藥廠生產(chǎn)，規(guī)格：200 mg，批號(hào)：100101）；替諾福韋標(biāo)準(zhǔn)品（含量：100%）、拉米夫定標(biāo)準(zhǔn)品（內(nèi)標(biāo)，含量：100%）均為杭州英譜科技技術(shù)發(fā)展有限公司提供；FTC標(biāo)準(zhǔn)品（四川百利制藥有限公司，含量：100%）；甲醇為色譜純，磷酸二氫鉀、醋酸銨、磷酸、氫氧化鈉、三氯乙酸均為國(guó)產(chǎn)分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱：Phecda C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；保護(hù)柱：Phenomenex?C18（4.0 mm×3.0 mm，5 μm）；流動(dòng)相：采用梯度洗脫，其中流動(dòng)相A為含0.08%三乙胺的20 mmol·L－1磷酸二氫鉀水溶液（稀磷酸調(diào)節(jié)pH值至3.5），流動(dòng)相B為甲醇（流動(dòng)相梯度洗脫程序見表1）；內(nèi)標(biāo)：拉米夫定；檢測(cè)波長(zhǎng)：270 nm；柱溫：35 ℃；流速：1 mL·min－1；進(jìn)樣量：100 μL；分析時(shí)間：30 min。

表1 流動(dòng)相梯度洗脫程序Tab 1 Gradient elution process of mobile phase

2.2 試驗(yàn)溶液的制備

2.2.1 替諾福韋標(biāo)準(zhǔn)溶液：準(zhǔn)確稱取替諾福韋標(biāo)準(zhǔn)品10.0 mg，加水溶解，得濃度為1.0 mg·mL－1的標(biāo)準(zhǔn)品貯備液，置于4℃冰箱中保存。試驗(yàn)前加水依次稀釋為系列標(biāo)準(zhǔn)溶液。

2.2.2 內(nèi)標(biāo)溶液：準(zhǔn)確稱取拉米夫定標(biāo)準(zhǔn)品15.0 mg，用流動(dòng)相溶解后定容于500 mL容量瓶中，制備成濃度為30.0 μg·mL－1的內(nèi)標(biāo)溶液，置于4℃冰箱中保存。

2.3 血漿樣品處理

精密量取血漿300 μL，加入內(nèi)標(biāo)溶液（30 μg·mL－1拉米夫定）20 μL，混勻后加入10%三氯乙酸180 μL，渦旋混勻30 s后于12000 r·min－1離心10 min，吸取上清液，加入1%氫氧化鈉水溶液240 μL中和、混勻，待固相萃取。Bond Elut C18固相萃取柱分別用甲醇3 mL、150 mmol·L－1醋酸銨（pH 5.0）3 mL活化平衡，然后將預(yù)處理后的血漿樣品注入固相萃取柱中，常壓下用100 mmol·L－1醋酸銨（pH 7.0）3 mL洗脫水溶性雜質(zhì)，抽干萃取柱，用甲醇500 μL洗脫并收集洗脫液，氮?dú)獯蹈?，流?dòng)相120 μL復(fù)溶，混勻，取100 μL供進(jìn)樣分析。

2.4 專屬性考察

按選定的色譜條件測(cè)得的替諾福韋、內(nèi)標(biāo)和血漿中的內(nèi)源性雜質(zhì)有很好的分離，特異性良好，其中替諾福韋、內(nèi)標(biāo)的保留時(shí)間分別為6.54、7.74 min。高效液相色譜圖見圖1。

圖1 高效液相色譜圖A.空白血漿；B.空白血漿+2000 ng·mL－1替諾福韋標(biāo)準(zhǔn)溶液+內(nèi)標(biāo)（200 ng·mL－1拉米夫定）溶液；C.受試者口服TDF片后血漿樣品；1.替諾福韋；2.拉米夫定Fig 1 HPLC chromatogramsA.blank plasma；B.blank plasma+2000 ng·mL－1tenofovir standard substance+internal standard（200 ng·mL－1lamivudine）；C.plasma sample of objects after oral dose of tenofovir disoproxil fumarate；1.tenofovir；2.lamivudine

2.5 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備

精密吸取空白血漿1800 μL，分別加入系列標(biāo)準(zhǔn)溶液各200 μL，再加入內(nèi)標(biāo)溶液，混勻，制備成含替諾福韋10.0、20.0、50.0、100.0、200.0、500.0、1000.0、2000.0、5000.0 ng·mL－1的血漿樣品，再按“2.3”項(xiàng)下方法處理，進(jìn)樣測(cè)定，記錄色譜。以替諾福韋與拉米夫定的峰面積比（Y）為縱坐標(biāo)，替諾福韋濃度（X）為橫坐標(biāo)，采用加權(quán)最小二乘法進(jìn)行線性回歸，得回歸方程為：Y＝0.0027X－0.0362（r＝0.9994）。結(jié)果表明，替諾福韋血藥濃度在10.0～5000.0 ng·mL－1范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，最低定量限為10.0 ng·mL－1。

2.6 精密度及回收率試驗(yàn)

制備20.0、200.0、2000.0 ng·mL－13種濃度的標(biāo)準(zhǔn)血漿樣品各5份，按“2.3”項(xiàng)下方法進(jìn)行操作、測(cè)定，連續(xù)5 d，根據(jù)隨行標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算樣品濃度，計(jì)算得到血漿中替諾福韋的日內(nèi)、日間精密度及方法回收率；另以血漿樣品中替諾福韋峰面積與其對(duì)照品峰面積比值計(jì)算平均提取回收率，結(jié)果見表2。

表2 回收率及精密度試驗(yàn)結(jié)果（±s ，n＝5）Tab 2 Results of recovery and precision tests（±s ，n＝5）

表2 回收率及精密度試驗(yàn)結(jié)果（±s ，n＝5）Tab 2 Results of recovery and precision tests（±s ，n＝5）

理論值/ng·mL-1 20.0200.02000.0方法回收率/%119.3±10.2105.4±3.6106.1±2.6日內(nèi)RSD/%9.63.82.4日間RSD/%9.36.35.4提取回收率/%95.5±6.072.8±3.273.5±2.6

2.7 穩(wěn)定性試驗(yàn)

制備20.0、200.0、2000.0 ng·mL－13種濃度的標(biāo)準(zhǔn)血漿樣品，分別按下述方法進(jìn)行處理，即－20℃反復(fù)凍融3次、－20℃存放50 d、常溫下放置24 h后，取樣測(cè)定，記錄峰面積。結(jié)果，3種濃度標(biāo)準(zhǔn)血漿樣品的RSD均＜5%，表明待測(cè)樣品在上述條件下穩(wěn)定。

2.8 受試者的選擇

中國(guó)西部男性健康志愿受試者24名，年齡22～27歲，身高168～176 cm，體重指數(shù)均在正常值（19～24）范圍內(nèi)。全面體格檢查結(jié)果良好，受試者無既往病史和藥物過敏史，精神狀態(tài)良好，血、尿常規(guī)，肝、腎功能及心電、心律、血壓均在正常范圍內(nèi)，試驗(yàn)前2周及試驗(yàn)期間未服用其他任何藥物，所有受試者均簽署知情同意書，試驗(yàn)方案經(jīng)重慶醫(yī)科大學(xué)醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)審批同意。

2.9 給藥方案與采血時(shí)間點(diǎn)

24名健康男性志愿受試者隨機(jī)分3組，每組8人，分別給予TDF片300 mg、FTC膠囊200 mg+TDF片300 mg、脂肪食物（食物中脂肪比例50%）+TDF片300 mg。受試者于試驗(yàn)當(dāng)日早晨埋置靜脈留置針，早晨8時(shí)給藥，分別于服藥前0 h和服藥后0.5、0.75、1、1.5、2、3、4、6、8、12、24、36、48、72 h時(shí)取靜脈血2 mL，分離血漿，置于－20℃冰箱中冷凍，待測(cè)。

2.10 數(shù)據(jù)處理

以DAS（Ver2.1.1）軟件計(jì)算藥動(dòng)學(xué)參數(shù)；運(yùn)用SPSS統(tǒng)計(jì)分析軟件，進(jìn)行藥動(dòng)學(xué)參數(shù)組間差異性統(tǒng)計(jì)（P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義）。

2.11 藥動(dòng)學(xué)參數(shù)考察

24名健康男性志愿受試者分別口服TDF片、FTC膠囊+TDF片、脂肪食物+TDF后測(cè)得替諾福韋的藥-時(shí)曲線見圖2。

圖2 健康志愿受試者口服TDF片后的藥-時(shí)曲線（±s，n＝8）Fig 2 Plasma concentration-time curves of tenofovi（r±s，n＝8）

DAS（Ver 2.1.1）軟件擬合結(jié)果顯示，TDF組、FTC+TDF組、脂肪食物+TDF組中FTC的藥-時(shí)數(shù)據(jù)均符合二室開放性藥動(dòng)學(xué)模型。擬合所有數(shù)據(jù)，得出藥動(dòng)學(xué)參數(shù)，其中cmax、tmax以實(shí)測(cè)值計(jì)算，受試者的主要藥動(dòng)學(xué)參數(shù)見表3。

表3 健康志愿受試者口服TDF片后的主要藥動(dòng)學(xué)參數(shù)（±s ，n＝8）Tab 3 Main pharmacokinetic parameters of TDF in healthy volunteers after oral dose of TDF tablets（±s ，n＝8）

表3 健康志愿受試者口服TDF片后的主要藥動(dòng)學(xué)參數(shù)（±s ，n＝8）Tab 3 Main pharmacokinetic parameters of TDF in healthy volunteers after oral dose of TDF tablets（±s ，n＝8）

與TDF組比較：＊P＜0.05，＊＊P＜0.01vs.TDF group：＊P＜0.05，＊＊P＜0.01

參數(shù)cmax/ng·mL-1 tmax/h t1/2/h AUC0～72/μg·h·L-1 AUC0～∞/μg·h·L-1 MRT0～72/h MRT0～∞/h CL/F/L·h-1·kg-1脂肪食物+TDF組429.06±174.81＊1.55±0.37＊13.08±1.47＊＊3569.47±633.47＊＊3856.00±618.39＊＊12.66±1.7216.73±2.751.33±0.20＊＊TDF組290.71±63.211.05±0.1618.78±3.281871.60±377.002284.16±373.5413.41±2.4625.44±4.162.25±0.39 FTC+TDF組420.84±96.71＊1.28±0.30＊12.72±2.83＊＊3869.42±962.85＊＊4107.09±974.82＊＊11.68±4.1315.04±4.411.28±0.28＊＊

利用SPSS統(tǒng)計(jì)分析軟件，分別將FTC+TDF組、脂肪食物+TDF組的主要藥動(dòng)學(xué)參數(shù)與TDF組經(jīng)兩組間配對(duì)t檢驗(yàn)。FTC+TDF組、脂肪食物+TDF組分別與TDF組比較，除MRT差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義外，其余參數(shù)差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 討論

研究發(fā)現(xiàn)，中國(guó)西部健康人群口服TDF片，tmax（1.05±0.16）h，t1/2（18.78±3.28）h，cmax為（290.71±63.21）ng·mL－1，AUC0～72與 AUC0～∞分別為（1871.60±377.00）、（2284.16±373.54）μg·h·L－1，與文愛東等[8]報(bào)道的研究結(jié)果相似。國(guó)外研究報(bào)道TDF口服給藥的主要藥動(dòng)學(xué)參數(shù)也與本研究結(jié)果相似。這些研究結(jié)果表明，中國(guó)西部健康人群?jiǎn)为?dú)給予TDF的藥動(dòng)學(xué)特征與國(guó)、內(nèi)外人群均相似。

中國(guó)西部健康人群聯(lián)合給予FTC與TDF，其藥動(dòng)學(xué)參數(shù)與單獨(dú)給藥組相比，MRT 無明顯差異，cmax、AUC0～72、AUC0～∞、tmax值明顯增加，而t1/2值降低。與我們的研究結(jié)果不同，國(guó)外研究報(bào)道與FTC合用，對(duì)替諾福韋的藥動(dòng)學(xué)參數(shù)無明顯影響[9]。我們的研究還發(fā)現(xiàn)，與TDF單獨(dú)給藥相比，給予脂肪飲食，替諾福韋達(dá)峰時(shí)間明顯延遲（tmax增加），生物利用度增加（cmax、AUC0～72和AUC0～∞值增加），代謝加快（t1/2β縮短）。與我們的研究結(jié)果相似的是，國(guó)外有研究報(bào)道替諾福韋單獨(dú)給藥時(shí)生物利用度約25%，而脂肪食物可使其提高到39%，且達(dá)峰時(shí)間延后約0.75 h，cmax提高約15%，AUC提高約35%[9]。研究結(jié)果提示中國(guó)西部健康人群可能與歐洲人群存在差異，合用FTC后，TDF在中國(guó)人群體內(nèi)的生物利用度提高，代謝速度也加快。

總之，這些研究結(jié)果提示，TDF單獨(dú)給予在中國(guó)西部健康人群的藥動(dòng)學(xué)特征與國(guó)外人群相似，而脂肪食物以及合用FTC可能明顯改變替諾福韋的藥動(dòng)學(xué)特征。這些研究結(jié)果對(duì)TDF及TDF聯(lián)合FTC用于中國(guó)人群HIV的治療，以及用于HIV高危人群暴露前預(yù)防，可提供重要的參考依據(jù)。

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