閆輝，閆凱，李金鳳（1.北京軍區(qū)天津療養(yǎng)院藥劑科，天津市 00191；.河北省藥品檢驗所，石家莊市 050011；.河北蕾越醫(yī)藥科技有限公司，石家莊市 050011）

曲匹地爾（Trapidil）系三唑嘧啶衍生物，其化學名為5-甲基-7-二乙胺基-1，2，4-三唑[1，5-α]嘧啶，是一種作用廣泛的心血管藥物，適用于冠心?。ㄐ慕g痛、心肌梗死）[1]的治療。目前國內(nèi)有曲匹地爾原料藥及片劑上市。國家食品藥品監(jiān)督管理局已批準河北長天藥業(yè)有限公司的曲匹地爾膠囊進行人體生物等效性試驗。在曲匹地爾標準[2]中，曲匹地爾原料藥采用薄層色譜法檢查有關(guān)物質(zhì)，而片劑無該項檢查。為保證藥品質(zhì)量，保障用藥安全，筆者采用高效液相色譜（HPLC）法中常用的不加校正因子的主成分自身對照法[3]，對正在研制中的新藥曲匹地爾膠囊中的有關(guān)物質(zhì)進行含量檢查，另將已上市的曲匹地爾片作為對比也進行了檢測。結(jié)果表明，所建立的方法較薄層色譜法靈敏度高、準確可靠、操作性強。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

1100型HPLC儀、1100型VWD紫外檢測器、Chemstation色譜工作站（美國Agilent公司）；BP211D型十萬分之一分析天平（德國Sartorius公司）。

1.2 試藥

曲匹地爾標準品（中國藥品生物制品檢定所，批號：100440-200301，純度：100%）；曲匹地爾原料藥（批號：090301，含量：99.6%）、曲匹地爾膠囊（批號：090601、090603、090605，規(guī)格：每粒100 mg）均由河北長天藥業(yè)有限公司提供；曲匹地爾片（武漢迪奧藥業(yè)公司，批號：20090302，規(guī)格：每片50 mg）；空白輔料膠囊（河北蕾越醫(yī)藥科技有限公司，批號：090609，除不加主藥曲匹地爾外，按處方量加入各輔料制成膠囊）；乙腈為色譜純，水為純化水，其余試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱：Agilent Zorbax Eclipse XDB-C18（250 mm×4.6 mm，5μm）；流動相：乙腈-0.01 mol·L－1醋酸鈉溶液（0.41 g醋酸鈉溶于500 mL水中）＝28∶72，pH約為7；檢測波長：292 nm；柱溫：室溫；流速：1.0 mL·min－1；進樣量：20 μL。理論板數(shù)按曲匹地爾峰計不低于2500，各峰與其相鄰峰的分離度大于1.5。

2.2 溶液的制備

2.2.1 曲匹地爾標準品溶液。精密稱取曲匹地爾標準品10 mg，置于25 mL容量瓶中，用水溶解并稀釋至刻度；精密量取2 mL，置于10 mL容量瓶中，用流動相稀釋至刻度，搖勻，即得80 μg·mL－1標準品溶液。

2.2.2 供試品溶液。取本品10粒（膠囊）或10片（片劑），稱定，精密稱取內(nèi)容物約20 mg（相當于曲匹地爾10 mg），置于25 mL容量瓶中，用水溶解稀釋至刻度，搖勻，經(jīng)0.45μm微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液2 mL，置于10 mL容量瓶中，用流動相稀釋至刻度，即得80 μg·mL－1供試品溶液。

2.2.3 1%對照溶液。精密量取供試品溶液1 mL，置于100 mL容量瓶中，用流動相稀釋至刻度，搖勻，即得0.80 μg·mL－1對照溶液（1%）。

2.2.4 空白輔料溶液。取空白輔料膠囊10粒，稱定，取內(nèi)容物，精密稱取適量（約10 mg），置于25 mL容量瓶中，用水溶解并稀釋至刻度，搖勻，經(jīng)0.45 μm微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液2 mL，置于10 mL容量瓶中，用流動相稀釋至刻度，即得。

2.3 輔料干擾試驗

照“2.1”項下的色譜條件，精密量取空白輔料溶液、曲匹地爾標準品溶液、供試品溶液各20 μL，分別注入液相色譜儀，記錄色譜，見圖1。

圖1 高效液相色譜圖A.空白輔料；B.標準品；C.供試品；1.曲匹地爾Fig 1 HPLC chromatogramsA.blank solution；B.reference substance；C.test sample；1.trapidil

由圖1可知，輔料對主藥的分析無干擾，輔料峰、雜質(zhì)峰與主成分峰均能完全分離。

2.4 降解物干擾考察

2.4.1 酸、堿、氧化試驗。精密稱取曲匹地爾膠囊內(nèi)容物適量（約相當于曲匹地爾10 mg）3份，分別置于25 mL納氏比色管中，分別加水10 mL，搖勻；按照下列方法進行試驗：（1）加1 mol·L－1鹽酸溶液5 mL，搖勻，常溫放置2 h；（2）加1 mol·L－1氫氧化鈉溶液5 mL，搖勻，常溫放置2 h；（3）加30%過氧化氫溶液1 mL，常溫放置2 h。將上述破壞性試驗溶液，分別加水適量，調(diào)pH值約6.5，用水稀釋至刻度，搖勻，經(jīng)0.45 μm微孔濾膜濾過。取續(xù)濾液2 mL，置于10 mL容量瓶中，用流動相稀釋至刻度，即得。

2.4.2 光照、高溫試驗。另取曲匹地爾膠囊內(nèi)容物適量2份，分別進行以下試驗：（1）置于白熾光（4500 lx）下照射5 d；（2）置于60℃烘箱中加熱5 d。精密稱取經(jīng)光照、高溫破壞后的內(nèi)容物適量（約相當于曲匹地爾10 mg），分別置于25 mL容量瓶中，用水溶解稀釋至刻度，搖勻，經(jīng)0.45 μm微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液2 mL，置于10 mL容量瓶中，用流動相稀釋至刻度，即得。

照“2.1”項下的色譜條件，精密量取上述酸、堿、氧化、光照、高溫試驗降解溶液各20 μL，分別注入液相色譜儀，記錄色譜，見圖2。

由圖2可知，本品除對高溫較穩(wěn)定外（在高溫條件下，未出現(xiàn)降解產(chǎn)物），其余酸、堿、氧化和光照試驗均產(chǎn)生了不同程度的降解產(chǎn)物，但降解產(chǎn)物峰均能與主成分峰完全分離，說明色譜條件的適用性較好。

2.5 檢測限考察

取供試品溶液用流動相稀釋成系列濃度，進樣，當信噪比為3時進樣量即為最低檢測限。測得最低檢測限為0.16 ng（S/N＝3）。

圖2 破壞試驗色譜圖A.酸破壞后樣品；B.堿破壞后樣品；C.氧化破壞后樣品；D.光照破壞后樣品；E.高溫破壞后樣品；1.曲匹地爾Fig 2 Chromatograms of destroyed sampleA.sample treated with acid；B.sample treated with alkali；C.sample treated with oxidation；D.sample treated with highlight；E.sample treated with heat；1.trapidil

2.6 耐用性考察

在“2.1”項色譜條件的基礎(chǔ)上，對流動相的組成、柱溫、流速、同類型不同品牌的色譜柱進行耐用性試驗。結(jié)果表明，當系統(tǒng)條件發(fā)生微小變化時，測定結(jié)果不受影響。說明本法的耐用性良好，符合測定要求。

2.7 有關(guān)物質(zhì)檢測

照“2.1”項下的色譜條件，精密量取對照溶液20 μL進樣，調(diào)節(jié)檢測靈敏度，使主成分色譜峰的峰高約為滿量程的20%；再精密量取供試品溶液與對照溶液各20 μL，分別進樣，記錄色譜圖至主成分峰保留時間的3倍。供試品溶液的色譜圖中如顯雜質(zhì)峰，單個雜質(zhì)峰面積不得大于對照溶液主峰面積的1/4（0.25%），各雜質(zhì)峰面積的和不得大于對照溶液主峰面積（1.0%）。4批樣品的有關(guān)物質(zhì)含量檢查結(jié)果見表1。

表1 4批樣品中有關(guān)物質(zhì)含量檢測結(jié)果Tab 1 The contents of related substances in 4 batches of sample

3 討論

在進行色譜條件篩選時，筆者曾使用不同品牌（Agilent、Waters Symmety、Shimadzu 和Diamonsil）、不同長度（150 mm和250 mm）的C18色譜柱進行試驗，經(jīng)多次調(diào)整達到了有效分離的要求，并最終確定使用Agilent公司、長度為250 mm的C18為色譜柱。

在前期試驗中，分別對曲匹地爾及其中間體3、中間體4（中間體3、4分別是倒數(shù)第3步和倒數(shù)第2步的反應(yīng)產(chǎn)物）在200～400 nm波長范圍內(nèi)進行紫外掃描，結(jié)果曲匹地爾在307 nm波長處有最大吸收峰，曲匹地爾中間體3、中間體4在277 nm波長處有最大吸收峰，而在307 nm波長處無吸收，但在292 nm波長處，主成分與有關(guān)物質(zhì)均有吸收，故最終確定檢測波長為292 nm。

破壞試驗結(jié)果表明，本品除對高溫因素較穩(wěn)定外，對酸、堿、氧化、光照等因素較敏感。

綜上所述，本方法專屬性強、適用性好、耐用性良好，可用于曲匹地爾膠囊及其片劑中有關(guān)物質(zhì)的含量檢測，并建議將有關(guān)物質(zhì)的檢測內(nèi)容增訂入曲匹地爾膠囊質(zhì)量標準中。該法也可用于曲匹地爾原料藥及其相關(guān)制劑中的有關(guān)物質(zhì)檢測，以有效控制產(chǎn)品質(zhì)量，確保藥品安全有效。

[1]國家藥品審評中心.藥物臨床信息參考[M].成都：四川科學技術(shù)出版社，2004：440.

[2]WS-10001-（HD-0327）-2002，曲匹地爾（片）藥品標準[S].2002.

[3]國家藥典委員會編.中華人民共和國藥典（二部）[S].2010年版.北京：中國醫(yī)藥科技出版社，2010：附錄ⅤD.