鄧 紅，張 蜀，林華慶，張肖玲，卜 水，李欣蔚（廣東藥學(xué)院藥物研究所/廣東省藥物新劑型重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣州市 510006）

鹽酸特比萘芬（Terbinafine hydrochloride）是一種新型的丙烯胺類抗真菌藥，是真菌角鯊烯環(huán)氧化酶特異性抑制劑，用于治療淺表皮膚真菌病，可經(jīng)皮膚給藥以達(dá)局部治療目的。本試驗(yàn)采用小型豬離體皮膚及改良Franz擴(kuò)散池，考察供試藥鹽酸特比萘芬乳膏的皮膚透過率以及皮膚局部貯藥量，并與上市產(chǎn)品鹽酸特比萘芬乳膏（商品名:蘭美抒?）進(jìn)行比較，旨在闡明制劑的起效途徑，預(yù)測(cè)供試藥與已上市產(chǎn)品的一致性。

1 儀器與材料

TK-12B型透皮擴(kuò)散試驗(yàn)儀（上海鍇凱科技貿(mào)易有限公司）；U3000高效液相色譜（HPLC）儀、二極管陣列檢測(cè)器（美國(guó)Dionex公司）；KQ-100TDB超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；LXJ-IIB型多管離心機(jī)（上海安亭科學(xué)儀器廠）。

供試藥鹽酸特比萘芬乳膏（批號(hào):090501，規(guī)格:0.1 g∶10 g）、空白基質(zhì)（批號(hào):100501）均由桂林華信制藥有限公司提供；對(duì)照藥1%鹽酸特比萘芬乳膏（商品名蘭美抒?，中美天津史克制藥有限公司，批號(hào):09110223）；鹽酸特比萘芬原料藥（濟(jì)南明鑫制藥有限公司，批號(hào):081108122，含量:99.7%）；鹽酸特比萘芬標(biāo)準(zhǔn)品（中國(guó)藥品生物制品檢定所，批號(hào):100563-200301，供含量測(cè)定用）；甲醇、乙腈均為色譜純，其余試劑為分析純。

西藏小型豬，♀♂各1只，體重35～40 kg，南方醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物許可證號(hào):SCXK（粵）2006-0015。

2 方法與結(jié)果

2.1 透皮擴(kuò)散試驗(yàn)方法的建立

2.1.1 透皮擴(kuò)散試驗(yàn)一般條件。采用立式改良Franz擴(kuò)散池（18 mL）及豬腹部離體皮膚。離體皮膚固定于樣品池與接受池之間，角質(zhì)層面向樣品池，均勻涂抹乳膏，皮膚背面與接受液緊密接觸（不得有氣泡）。有效擴(kuò)散面積約3.3 cm2，接受系統(tǒng)置于（37±0.5）℃的恒溫水浴中，電磁攪拌，轉(zhuǎn)速為180 r·min－1。分別于1、3、6、12、24 h取接受液2 mL，并補(bǔ)充相同體積的接受液，24 h后終止試驗(yàn)。

2.1.2 豬離體皮膚的處理。取豬放血處死，經(jīng)觀察皮膚無(wú)紅腫、充血、破損現(xiàn)象。用電動(dòng)剃須刀除去腹部毛，取下已去毛的腹部豬皮，小心除去皮下脂肪，洗凈，切割成小塊皮膚，立即進(jìn)行透皮試驗(yàn)，其余離體皮膚浸泡于生理鹽水中，置于－4℃冰箱中備用。

2.1.3 接受液的選擇。接受液應(yīng)具有接受透皮藥物的能力，并盡可能符合類似體內(nèi)的漏槽條件，常用的接受液有生理鹽水和等滲的磷酸鹽緩沖液等[1]。鹽酸特比萘芬易溶于無(wú)水乙醇或甲醇，微溶或極微溶于水[2]，根據(jù)藥物的性質(zhì)和接受液盡可能接近體內(nèi)環(huán)境的原則，制備了系列溶液進(jìn)行溶解度試驗(yàn)，結(jié)果鹽酸特比萘芬原料藥在各溶液中的溶解度由大到小依次為:3%甲醇溶液＞水≈含0.2%聚山梨酯-80的生理鹽水＞生理鹽水（0.9%氯化鈉溶液）＞pH7.4磷酸鹽緩沖液（取磷酸二氫鉀1.36 g，加0.1 mol·L－1氫氧化鈉溶液79 mL，用水稀釋至200 mL，即得）。參考文獻(xiàn)[3，4]，在皮膚擴(kuò)散面積為3.3 cm2時(shí)，體外透皮試驗(yàn)用乳膏量通常為0.2～1 g，當(dāng)乳膏用量為1 g時(shí)，若藥物的皮膚透過率分別為100%、50%和10%，則接受液中的藥物濃度分別為0.56、0.28 、0.056 mg·mL－1，據(jù)此考察鹽酸特比萘芬原料藥在3%甲醇溶液、水與生理鹽水中能否達(dá)到漏槽條件，結(jié)果見表1。

表1 漏槽條件試驗(yàn)結(jié)果Tab 1 Results of sink condition test

可見，藥物在上述3種溶劑中能否達(dá)到漏槽條件要視乳膏中藥物的皮膚透過率而定。因此，結(jié)合藥物的性質(zhì)及人體體液的實(shí)際情況，初步選定3%甲醇溶液、水與生理鹽水為接受液。

2.1.4 透皮擴(kuò)散試驗(yàn)的條件確定。分別取0.2、0.5、1.0 g供試藥，均勻涂抹于豬離體皮膚上，分別以上述3種溶液為接受液，每種乳膏用量用每種接受液各做1份，按“2.1.1”項(xiàng)下方法試驗(yàn)，過濾，濾液注入液相色譜儀測(cè)定，結(jié)果3種不同用量供試品在3種接受液中均未檢出鹽酸特比萘芬。因此，在樣品池能承載的前提下，選定試驗(yàn)用乳膏量為1.0 g；由于預(yù)試驗(yàn)結(jié)果乳膏中藥物幾乎不透過皮膚（即皮膚透過率＜10%），生理鹽水完全可達(dá)到漏槽條件，因此，接受液選定生理鹽水。

2.2 含量測(cè)定方法的建立

2.2.1 色譜條件。色譜柱:Gemini C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相:乙腈-甲醇-pH7.5緩沖液（50∶40∶10）（其中緩沖液的制備方法為:取2.0 mL三乙胺，加水至1000 mL，稀醋酸調(diào)節(jié)pH至7.5）；流速:1 mL·min－1；檢測(cè)波長(zhǎng):224 nm；柱溫:室溫；進(jìn)樣量:20μL。在此條件下，鹽酸特比萘芬的保留時(shí)間約為10 min，理論板數(shù)不低于10000。

2.2.2 溶液的制備。精密稱取鹽酸特比萘芬標(biāo)準(zhǔn)品0.01146 g，置于200 mL容量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，作為標(biāo)準(zhǔn)品貯備液。精密量取上述溶液1 mL置于10 mL容量瓶中，加生理鹽水稀釋至刻度，作為標(biāo)準(zhǔn)品溶液（5.73 μg·mL－1，約相當(dāng)于乳膏透過1%的濃度）。

由于透皮擴(kuò)散預(yù)試驗(yàn)中，各種條件在接受液中均未檢出鹽酸特比萘芬，因此，取上述標(biāo)準(zhǔn)品貯備液1 mL置于10 mL容量瓶中，加空白基質(zhì)透過皮膚所得的生理鹽水空白滲透液稀釋至刻度，濾過，作為供試品溶液a；另取做完擴(kuò)散試驗(yàn)的整塊皮膚，刮去表面殘留藥膏，用生理鹽水沖洗，稍晾干，剪去多余皮膚，將與軟膏接觸的面積約為3.3 cm2的皮膚剪碎研磨至乳糜狀，移至具塞錐形瓶中，加入20 mL無(wú)水乙醇，超聲提取40 min，5000 r·min－1離心，傾取上清液，濾過，揮干，用甲醇溶解，移至5 mL容量瓶并稀釋至刻度，即得供試品溶液b。

取空白基質(zhì)1 g，按“2.1.1”項(xiàng)下方法試驗(yàn)，24 h后取出空白基質(zhì)透過皮膚所得的全部接受液，作為陰性對(duì)照溶液a；取下皮膚，按上述供試品溶液b的制備方法制備，得皮膚貯留的陰性對(duì)照溶液b。

2.2.3 專屬性試驗(yàn)。分別取上述標(biāo)準(zhǔn)品溶液、供試品溶液和陰性對(duì)照溶液注入液相色譜儀，記錄色譜。結(jié)果，在同一色譜條件下，接受液的陰性對(duì)照溶液a和皮膚貯留的陰性對(duì)照溶液b均對(duì)測(cè)定無(wú)干擾，詳見圖1。

圖1 高效液相色譜圖1.陰性對(duì)照溶液a；2.標(biāo)準(zhǔn)品；3.供試品溶液a；4.陰性對(duì)照溶液b；5.標(biāo)準(zhǔn)品；6.供試品溶液b；①.鹽酸特比萘芬Fig 1 HPLC chromatograms1.negative control a；2.standard substance；3.test sample a；4.negative control b；5.standard substance；6.test sample b；①.terbinafine hydrochloride

2.2.4 線性及范圍。分別精密吸取標(biāo)準(zhǔn)品溶液1、5、10、20、30、40、50μL進(jìn)樣，按上述色譜條件測(cè)定，將所得峰面積（A）與實(shí)際進(jìn)樣量（X，μg）進(jìn)行線性回歸，得線性方程為A＝222.19X+0.2442（r＝0.9999），表明鹽酸特比萘芬進(jìn)樣量線性范圍為0.00573～0.2865 μg。

2.2.5 回收率試驗(yàn)。（1）皮膚透過量的回收率試驗(yàn):經(jīng)透皮擴(kuò)散預(yù)試驗(yàn)，接受液中未檢出鹽酸特比萘芬，因此回收率試驗(yàn)選擇了相當(dāng)于透過0.3%、0.7%、1%3種較低的濃度進(jìn)行。取空白基質(zhì)各1 g共6份，均勻涂抹于離體皮膚上，以生理鹽水為接受液，按“2.1.1”項(xiàng)下方法試驗(yàn)，24 h后取出全部接受液，作為空白滲透溶液；取下試驗(yàn)后的皮膚，刮去表面殘留空白基質(zhì)，用生理鹽水洗凈，備用。精密量取“2.2.2”項(xiàng)下標(biāo)準(zhǔn)品貯備液0.3、0.7、1 mL各3份，分別置于10 mL容量瓶?jī)?nèi)，加空白滲透溶液稀釋至刻度；濾過，取濾液，依法測(cè)定，記錄色譜，代入線性方程，計(jì)算得平均回收率為93.43%，RSD為6.92%。（2）皮膚貯留量的回收率試驗(yàn):取上述空白試驗(yàn)后的皮膚（6塊），剪去多余皮膚，將與空白基質(zhì)接觸的面積約為3.3 cm2的皮膚剪碎并研磨至乳糜狀，平均分成6份，分別置于具塞錐形瓶中，分別精密加入“2.2.2”項(xiàng)下標(biāo)準(zhǔn)品貯備液1 mL，再加無(wú)水乙醇20 mL，超聲提取40 min，5000 r·min－1離心，傾取上清液，濾過，揮干，用甲醇溶解，移至5 mL容量瓶并稀釋至刻度，濾過；取濾液，依法測(cè)定，記錄色譜，計(jì)算得平均回收率為91.68%，RSD為5.76%。

2.2.6 最低定量限及最低檢測(cè)限。精密量取供試品溶液a 1 mL（2份），分別置于50、20 mL容量瓶中，加生理鹽水稀釋至刻度，制成濃度分別為0.1146、0.2865 μg·mL－1的溶液，進(jìn)樣，以信噪比為3時(shí)作為最低檢測(cè)限，信噪比為10時(shí)作為最低定量限，結(jié)果得鹽酸特比萘芬的最低檢測(cè)限為0.078 μg·mL－1（相當(dāng)于皮膚透過率0.01%），最低定量限為0.29 μg·mL－1（相當(dāng)于皮膚透過率0.05%）。

2.2.7 儀器精密度試驗(yàn)。取回收率試驗(yàn)中皮膚透過量供試品溶液和皮膚貯留量供試品溶液，分別連續(xù)進(jìn)樣6次，記錄峰面積，計(jì)算RSD值分別為1.2%、1.7%，表明精密度良好。2.2.8 穩(wěn)定性試驗(yàn)。取回收率試驗(yàn)中皮膚透過量供試品溶液和皮膚貯留量供試品溶液，分別在于0、1、4、9、12、24 h各測(cè)定1次，記錄峰面積，計(jì)算其RSD值。結(jié)果溶液在9 h內(nèi)較穩(wěn)定（RSD分別為2.6%、2.2%），在24 h時(shí)峰面積均略呈下降趨勢(shì)，因此，取樣后應(yīng)盡快測(cè)定。

2.3 透皮擴(kuò)散試驗(yàn)結(jié)果

取供試藥和對(duì)照藥依法進(jìn)行透皮擴(kuò)散試驗(yàn)，分別于1、3、6、12、24 h取接受液2 mL（并即時(shí)補(bǔ)充同溫度同體積的生理鹽水），過濾，濾液注入液相色譜儀，測(cè)定藥物的皮膚透過率（累積透過率（%）＝（）（/W樣×標(biāo)示量×106）×100%。其中，cn為第n個(gè)取樣點(diǎn)的藥物濃度（μg·mL－1）；ci為第（ii≤n－1）個(gè)取樣點(diǎn)的藥物濃度（μg·mL－1）；W樣為取樣量（g）；標(biāo)示量為10 g∶0.1 g。24 h終止試驗(yàn)后，立即取出皮膚，按“2.2.2”項(xiàng)下供試品溶液b的制備方法制備供試品溶液，依法測(cè)定藥物皮膚的貯留量，結(jié)果見表2。

表2 透皮擴(kuò)散試驗(yàn)結(jié)果（n＝6）Tab 2 Results of transdermal diffusion test（n＝6）

可見，2種樣品中鹽酸特比萘芬?guī)缀醪煌高^皮膚，皮膚局部貯藥量相近。

3 討論

由于人皮膚很難獲得，根據(jù)文獻(xiàn)[5]小型豬的皮膚與人的皮膚較為接近，因此選用小型豬腹部皮膚作為體外透皮吸收對(duì)比試驗(yàn)的離體皮膚。

[2，6]比較了不同的色譜條件，最終確定了本試驗(yàn)所采用的色譜條件；鹽酸特比萘芬在大約224、280 nm波長(zhǎng)處有最大吸收，其中224 nm波長(zhǎng)處的響應(yīng)值較大，而本品的皮膚透過率和皮膚貯藥量低，為提高檢測(cè)靈敏度，選定224 nm為測(cè)定波長(zhǎng)；檢測(cè)方法中的回收率值結(jié)果偏低、RSD值偏大，分析原因可能是檢測(cè)的濃度較低及皮膚細(xì)胞的某些脂質(zhì)成分可能對(duì)藥液略有干擾所致。

鹽酸特比萘芬乳膏是經(jīng)皮膚給藥以達(dá)局部治療目的，不主張透過皮膚起全身治療作用。本試驗(yàn)采用小型豬離體皮膚及改良Franz擴(kuò)散池，考察藥物的皮膚透過率，以及皮膚局部的載藥情況，結(jié)果2種樣品中鹽酸特比萘芬?guī)缀醪煌高^皮膚，皮膚局部貯藥量相近，說明鹽酸特比萘芬乳膏發(fā)揮的是局部治療作用，預(yù)測(cè)2種制劑的藥效和安全性基本一致。

參考文獻(xiàn)

[1]梁 穎，楊新建.4種透皮吸收促進(jìn)劑對(duì)鹽酸苯海拉明透皮性能的影響[J].中國(guó)藥房，2008，19（31）:2414.

[2]British Pharmacopoeia Commission.Terbinafine hydrochloride[DB/OL].www.drugfuture.com/Pharmacopoeia/BP 2009/download.aspx?filename=Terbinafine-Hydrochloride-5893.2010-08-03.

[3]李冬梅，路緒文，蘇 芳，等.阿西美辛脂質(zhì)體凝膠劑的體外透皮擴(kuò)散研究[J].中國(guó)醫(yī)院藥學(xué)雜志，2003，23（6）:330.

[4]陳 鷹，湯 韌，劉 輝，等.阿昔洛韋棕櫚酸酯脂質(zhì)體凝膠劑的局部透皮試驗(yàn)[J].中國(guó)醫(yī)院藥學(xué)雜志，2000，20（6）:324.

[5]謝松梅，楊志敏，呂 東，等.新法規(guī)下皮膚外用藥物臨床試驗(yàn)要求的相關(guān)考慮[EB/OL].www.cde.org.cn/dzkw.do?method=largePage&id=311532.2009-12-02.2010-06-23.

[6]余仕汝，高邵陽(yáng)，朱紅玲，等.鹽酸特比萘芬乳膏含量測(cè)定方法的改進(jìn)研究[J].藥物分析雜志，2008，28（4）:656.