羅 斌，王世夫，應(yīng)香嵐，阮正英，陳 豪

趨化因子在腫瘤生長、浸潤和轉(zhuǎn)移等生物學(xué)行為中可能起著非常重要的作用，有望成為腫瘤治療的新靶點之一[1]。不同種類的趨化因子在不同的腫瘤細(xì)胞中可能起著不同的作用，一些可能促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的生長和轉(zhuǎn)移，而另一些則起著抑制作用。趨化素樣因子（chemokine like factor，CKLF）和生長相關(guān)癌基因（growth-related oncogene，GRO）在腸癌發(fā)病機(jī)制中的作用如何，目前知之甚少。本研究收集我院和臺州市腫瘤醫(yī)院2008年1月—2010年4月收治的結(jié)、直腸癌患者20例，通過檢測CKLF與GRO表達(dá)來探討其在結(jié)直腸癌發(fā)病中的可能作用機(jī)制。

1 資料與方法

1.1 研究對象 本組20例均經(jīng)手術(shù)和病理確診，術(shù)前均未接受放療或化療。其中結(jié)腸癌5例，直腸癌15例。病理分型:中分化腺癌12例，低分化4例，黏液腺癌2例，中分化黏膜內(nèi)癌和印戒細(xì)胞癌各1例。伴有腹腔淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移10例。男性16例，女性4例，年齡34～83歲，平均（64±14）歲。術(shù)畢立即取腫瘤組織及癌旁組織，每例以距腫瘤5cm以上的正常腸黏膜組織作為正常對照。

1.2 主要試劑 兔抗人GROα和CKLF-2多克隆抗體為美國Biomedical Technologies公司產(chǎn)品，免疫組化試劑盒（S-P）和DAB染色試劑均購自上海太陽生物有限公司。

1.3 免疫組化方法 標(biāo)本經(jīng)10%甲醛固定、酒精脫水、石蠟包埋、切片、抗原修復(fù)，3%過氧化氫滅活內(nèi)源性過氧化物酶，兔血清封閉，滴加—抗、二抗及鏈霉素抗生物素蛋白-過氧化物酶復(fù)合物，DAB顯色、復(fù)染、封片。PBS代替一抗作陰性對照。GROα和CKLF-2的抗體稀釋濃度均為1∶100。

1.4 結(jié)果判定 光鏡下觀察細(xì)胞著色情況，陽性細(xì)胞的胞漿染色呈棕黃色。每張切片隨機(jī)選擇5個視野，Image-pro Plus 5.1免疫組化圖像分析系統(tǒng)對陽性細(xì)胞進(jìn)行灰度掃描[2]，取其平均值代表該片的光密度值（OD值）。

2 結(jié)果

2.1 腸癌組織鏡下表現(xiàn) 腫瘤細(xì)胞呈不規(guī)則腺管樣、乳頭樣排列，腺體互相吻合或不完整，細(xì)胞增生，核位于基底呈假復(fù)層或復(fù)層、極性紊亂、異形明顯、胞漿較豐富，可見黏液分泌及杯狀空泡，腫瘤細(xì)胞浸潤腸壁。

2.2 GROα和CKLF-2蛋白的表達(dá) 陽性細(xì)胞的胞漿染色呈棕黃色，GROα和CKLF-2蛋白主要表達(dá)在腸癌細(xì)胞和正常腸腺上皮細(xì)胞的胞漿內(nèi)。腸癌組織中GROα蛋白的表達(dá)水平顯著高于對照組（P＜0.01)，而腸癌組織中CKLF-2蛋白的表達(dá)水平顯著低于對照組 (P＜0.01，見表1，圖1～圖4)。

表1 兩組GROα和CKLF-2蛋白表達(dá)水平的比較（OD值，）

表1 兩組GROα和CKLF-2蛋白表達(dá)水平的比較（OD值，）

注:與對照組比較，*P＜0.01

組別對照組腸癌組n 2020gROα 0.150±0.0510.236±0.078*CKLF-20.189±0.0630.133±0.039*

圖1 正常腸組織上皮細(xì)胞胞漿中GRO α蛋白表達(dá)（SP×200）

圖2 腸癌組織上皮細(xì)胞胞漿中GRO α蛋白表達(dá)（SP×200）

圖3 正常腸組織上皮細(xì)胞胞漿中CKLF-2蛋白表達(dá)（SP×200）

圖4 腸癌組織上皮細(xì)胞胞漿中CKLF-2蛋白表達(dá)（SP×200）

3 討論

腫瘤的形成和轉(zhuǎn)移是一個十分復(fù)雜的、非隨機(jī)的過程。趨化因子可能涉及腫瘤細(xì)胞的生長、增殖、遷移、遠(yuǎn)處黏附及轉(zhuǎn)移灶生成等幾個關(guān)鍵步驟[3]。趨化因子能募集特定的白細(xì)胞到達(dá)炎癥區(qū)域執(zhí)行功能，這種作用對防御微生物感染和創(chuàng)傷修復(fù)是非常有益處的。趨化因子持續(xù)異常的高表達(dá)，會使募集的白細(xì)胞大量增加而形成破壞性損傷。另外，白細(xì)胞介導(dǎo)的損傷又使趨化因子繼續(xù)高表達(dá)或使其他類型的趨化因子表達(dá)增加，產(chǎn)生更廣泛的組織損傷，從而使白細(xì)胞對機(jī)體的保護(hù)作用被破壞而引起病變，增加癌變幾率。趨化因子在腫瘤的生物學(xué)行為中表現(xiàn)出雙向調(diào)節(jié)作用。一方面，趨化因子可以趨化腫瘤內(nèi)某些免疫活性細(xì)胞，增強抗腫瘤免疫作用，或者抑制腫瘤內(nèi)新生血管的生成，間接抑制腫瘤的生長[4]。另一方面，趨化因子及其受體可刺激腫瘤細(xì)胞的生長，或者抑制機(jī)體的抗腫瘤免疫從而促進(jìn)腫瘤的生長[5]。

趨化因子是細(xì)胞因子超家族成員中一類小分子量的可溶性蛋白質(zhì)(8～11 kD)，根據(jù)其N端兩個保守的半胱氨酸殘基之間間隔的距離不同，可將趨化因子分為 4類:C、CC、CXC和 CX3 C，其中CXC類又根據(jù)是否有谷氨酸-亮氨酸-精氨酸(ELR)基序分為ELR+趨化因子和 ELR-趨化因子[6]。目前認(rèn)為，ELR+-CXC趨化因子是有效的促進(jìn)腫瘤血管生長因子，如白細(xì)胞介素（IL）-8、Gro等[7]；而ELR--CXC趨化因子則是抑制腫瘤血管生長的因子，如巨噬細(xì)胞移動抑制因子（MIP）-1α、IL-12、IL-18等。

研究發(fā)現(xiàn)，CC類趨化因子在結(jié)、直腸癌的原發(fā)灶及轉(zhuǎn)移灶中可能起了重要作用，可能成為結(jié)、直腸癌靶向治療的重要靶點。CKLF是一種新發(fā)現(xiàn)的具有CC類趨化因子特征性結(jié)構(gòu)的細(xì)胞因子，即兩個連續(xù)的半胱氨酸，并對多種白細(xì)胞具有趨化作用，表達(dá)于多種細(xì)胞和組織。CKLF作用的機(jī)制可能存在直接作用和間接作用，而后者是通過趨化并活化大量免疫細(xì)胞如淋巴細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、中性粒細(xì)胞而發(fā)揮作用。CKLF與心肌梗死、心肌肥厚、肺組織的炎癥和損傷、哮喘等疾病的發(fā)生有關(guān)。但其在腫瘤發(fā)病機(jī)制中是否具有CC類趨化因子相似的作用，目前報道較少。有研究表明，CKLF-1和CKLF-4在正常肺組織中呈高表達(dá)，而在肺癌組織中表達(dá)下降，肺腺癌組織的表達(dá)明顯高于鱗癌組織，它們可能是非小細(xì)胞肺癌的抑癌基因[8]。而在卵巢癌組織中CKLF-1的表達(dá)水平卻呈現(xiàn)相反的結(jié)果，其在正常卵巢、良性及惡性卵巢上皮性腫瘤中的表達(dá)水平依次增高；且隨著腫瘤組織病理分型的惡性程度增加,CKLF-1的表達(dá)水平也相應(yīng)增高；伴有遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移或伴有腹水的腫瘤組織，其表達(dá)水平高于不伴有遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移或不伴有腹水的腫瘤組織。認(rèn)為CKLF-1可能與上皮性卵巢癌的發(fā)生、侵襲、轉(zhuǎn)移及不良預(yù)后相關(guān)[9]。上述結(jié)論提示，不同（或相同）的CKLF亞型在不同（或相同）的癌組織的表達(dá)可能不盡相同，值得進(jìn)一步研究。

本研究發(fā)現(xiàn)，結(jié)、直腸癌組織中CKLF-2蛋白表達(dá)水平顯著低于癌組織周圍正常的黏膜組織，提示隨著組織的惡性程度增加，CKLF-2的表達(dá)下降，在結(jié)、直腸癌組織的發(fā)生中可能起了抑癌作用，其機(jī)制有待于進(jìn)一步研究。

GROα屬于ELR+-CXC趨化因子，系統(tǒng)命名為CXCL1，因為可以刺激黑色素細(xì)胞生長，所以曾被稱為黑色素瘤生長刺激因子，在多種細(xì)胞上表達(dá)，包括血管內(nèi)皮細(xì)胞。它能參與機(jī)體的多種病理生理過程，如介導(dǎo)白細(xì)胞趨化、參與炎性反應(yīng)、創(chuàng)傷愈合、病毒感染等。近年來，越來越多的研究開始關(guān)注GROα與惡性腫瘤的關(guān)系。有研究認(rèn)為其在促進(jìn)腫瘤發(fā)生發(fā)展、促進(jìn)血管的新生和白細(xì)胞浸潤、促進(jìn)腫瘤細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移等過程中可能起了重要的作用[10]。

本研究發(fā)現(xiàn)，結(jié)、直腸癌組織中GROα蛋白表達(dá)水平顯著高于癌周圍正常的黏膜組織，提示隨著組織的惡性程度增加，GROα的表達(dá)增高，在腫瘤的生長中可能起了促進(jìn)作用。相似的研究也表明，在結(jié)、直腸癌組織標(biāo)本中GROαmRNA的表達(dá)水平也顯著高于癌周圍正常的黏膜組織[11]。進(jìn)一步支持GROα可能有促進(jìn)腫瘤細(xì)胞生長的作用。

結(jié)、直腸癌組織中GROα表達(dá)增加，可能對腸癌組織的生長有促進(jìn)作用；而CKLF-2的表達(dá)下降，提示其對腸癌組織的生長可能有抑制作用。趨化因子在調(diào)節(jié)腫瘤進(jìn)展和侵襲過程中所發(fā)揮的多種作用正被逐一挖掘，但仍有許多方面未闡明，如腫瘤的異質(zhì)性，即不同的腫瘤受不同的趨化因子組調(diào)控，不同腫瘤及其轉(zhuǎn)移部位分泌的一系列細(xì)胞因子的相互作用關(guān)系等，都有待于進(jìn)一步深入研究。以趨化因子及其受體為靶點的藥物治療可能成為一種新的抗癌療法。

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