張 寧，呂慧怡*，鄧 卅，范 青

西羅莫司(Sirolimus，SRL，商品名 Rapamune，雷帕霉素)，是一種大環(huán)內(nèi)酯類免疫抑制劑，具有抗增殖、抗腫瘤及無(wú)腎毒性等特性，近年來(lái)逐漸應(yīng)用于肝移植患者，使臨床獲得了防治肝移植術(shù)后腎功能不全、慢性排斥反應(yīng)、腫瘤復(fù)發(fā)和提高移植物長(zhǎng)期存活的新途徑［1］。血藥濃度監(jiān)測(cè)對(duì)于保證SRL免疫抑制效果和臨床安全性具有重要的意義。本文采用高效液相色譜法測(cè)定西羅莫司血藥濃度，并分析此方法在肝移植患者中的合理應(yīng)用。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 儀器 日本島津HPLC色譜儀(LC-20AT二元梯度泵，COM-20A控制模塊，SPD-M20A二極管陣列檢測(cè)器)，QT-330型色譜柱恒溫箱(大連三杰科技發(fā)展有限公司)，wi2568529電動(dòng)離心機(jī)(東儀科技有限公司)，AS701KDT型超聲波清洗器(北京鴻泰順達(dá)科技有限公司)，XY-22型濃縮氮吹儀(青島新益通有限公司)，YKH-Ⅱ 型液體快速混旋器(江西醫(yī)療器械廠)，AW-120型分析天平(日本島津)。

1.2 藥品與試劑 西羅莫司對(duì)照品(純度為98.0%，天津新美科技有限公司)，32-去甲基雷帕霉素(純度為98.0%，天津新美科技有限公司)，甲醇(色譜純，天津康巢正興科技發(fā)展有限公司)，氫氧化鈉(分析純，上海慈太龍實(shí)業(yè)有限公司)，乙腈(色譜純，天津市康巢科技開(kāi)發(fā)有限公司)，硫酸鋅(分析純，上海光鏵科技有限公司)，1-氯正丁烷(≥99.5，廣州偉伯化工有限公司)。

2 實(shí)驗(yàn)方法與結(jié)果

2.1 色譜條件 色譜柱:Hypersil ODS C18柱(250 mm ×4.6 mm，5 μm，大連伊利特分析儀器有限公司);流動(dòng)相:乙腈-甲醇-水(7.5∶62.5∶30);流速:1.2 mL/min;紫外檢測(cè)波長(zhǎng):276 nm;進(jìn)樣量:20 μL;柱溫:50℃;內(nèi)標(biāo)物:32-去甲基雷帕霉素。在上述色譜條件下，全血中內(nèi)源性雜質(zhì)不影響西羅莫司與內(nèi)標(biāo)的分離測(cè)定，西羅莫司與內(nèi)標(biāo)的保留時(shí)間分別為16.3、26.8 min，空白全血、對(duì)照品及全血樣品色譜圖，如圖1。

2.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制

2.2.1 西羅莫司對(duì)照品溶液配制 精密稱取西羅莫司標(biāo)準(zhǔn)品1 mg，置于10 mL的容量瓶中，以甲醇溶解并定容，制得濃度為100 μg/mL的西羅莫 司標(biāo)準(zhǔn)溶液，備用。

圖1 西羅莫司的高效液相色譜圖注:A.空白全血;B.對(duì)照品;C.全血樣品;Ⅰ-SRL，Ⅱ-內(nèi)標(biāo)

2.2.2 內(nèi)標(biāo)溶液配制 精密稱取32-去甲基雷帕霉素0.5 mg，置于10 mL容量瓶中，以甲醇溶解并定容，制成濃度為50 μg/mL的內(nèi)標(biāo)液。精密量取內(nèi)標(biāo)液1 mL，置于100 mL的容量瓶中，以甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻制得500 ng/mL的內(nèi)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)溶液，備用。

2.3 樣品的處理 精密量取全血1.0 mL，置10 mL具塞離心試管中，加入500 ng/mL的內(nèi)標(biāo)溶液20 μL，旋渦混合 30 s后，加入蛋白沉淀劑(甲醇∶25%ZnSO4=70∶30)2.0 mL，旋渦混合30 s，4 500 r/min離心 10 min，取上清液加入0.1 mol/L NaOH 溶液 400 μL，混勻 15 s，加入1.0 mL 1-氯正丁烷，水平振蕩10 min，4 500 r/min離心10 min。分離有機(jī)層，下層水相加入1.0 mL的1-氯正丁烷重復(fù)提取1次，合并有機(jī)層以N2流吹干。殘?jiān)尤爰状?0 μL旋渦混合30 s。取20 μL進(jìn)樣，記錄色譜圖，以SRL峰面積(Ai)與內(nèi)標(biāo)峰面積(As)之比Y代入標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算SRL全血濃度。

2.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線 分別精密吸取不同體積的西羅莫司標(biāo)準(zhǔn)溶液，置于10 mL具塞離心管中，加入精密量取的空白全血1.0 mL，混勻，使其濃度分別為2.0、4.0、8.0、15.0、30.0、50.0 ng/mL。按“2.3”操作，以不同濃度西羅莫司系列溶液的Ai/As來(lái)計(jì)算Y(Y=Ai/As)，以Y值為縱坐標(biāo)、西羅莫司濃度C為橫坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸。在2.0～50.0 ng/mL濃度范圍內(nèi)，血藥濃度與峰面積比有良好線性關(guān)系，其回歸方程為:Y=0.119 5 C+0.054 8(r=0.999 7)。

2.5 回收率及精密度 分別在1.0 mL空白全血中加入低、中、高3種濃度的西羅莫司溶液40 μL，混勻，使其濃度分別為 4.0、15.0、50.0 ng/mL，按“2.3”方法操作，將SRL峰面積與內(nèi)標(biāo)峰面積之比Y代入標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算SRL全血濃度，以測(cè)得值與加入值之比計(jì)算相對(duì)回收率，分別為101.0%、94.3%和101.9%(n=5)。另以1.0 mL空白全血不加藥品，按“2.3”操作，待萃取完畢后，在有機(jī)層中加入50%甲醇配制成的相應(yīng)濃度的SRL溶液1.0 mL及內(nèi)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)溶液20 μL，繼續(xù)按“2.3”操作，以此為標(biāo)準(zhǔn)，將測(cè)定相對(duì)回收率所得濃度值與此方法所測(cè)得濃度值相比，計(jì)算SRL絕對(duì)回收率分別為85.4%、81.9%和79.4%(n=5)。按照測(cè)定相對(duì)回收率方法計(jì)算SRL全血濃度，以1 d內(nèi)5次測(cè)得的SRL濃度計(jì)算日內(nèi)精密度，分別為3.3%、1.1%、3.1%，以1周內(nèi)5次測(cè)定的SRL濃度計(jì)算日間精密度，分別為6.3%、1.4%、5.4%。日內(nèi)、日間RSD均小于10%，表明該方法精密度良好。

3 臨床應(yīng)用

肝移植術(shù)后患者5例，男3例，女2例，平均年齡(40.2±11.5)歲。移植術(shù)后初期均采用以他克莫司為主的抗排斥治療方案，其中2例患者術(shù)后1個(gè)月內(nèi)腎功能減退，懷疑因藥物副作用引起［2］，另外3例于術(shù)后6個(gè)月出現(xiàn)不能耐受的藥物不良反應(yīng)，如高血糖、肌肉酸痛等，換以西羅莫司為主的抗排斥治療方案［3］。在服用西羅莫司片達(dá)到穩(wěn)態(tài)后，在一次給藥間隔口服西羅莫司2 mg后，于0、0.5、1.0、1.5、2.0、3.0、4.0、6.0、8.0、12.0、16.0、24.0 h測(cè)定西羅莫司全血濃度(藥-時(shí)曲線如圖2)。應(yīng)用DAS 2.0版，藥物代謝動(dòng)力學(xué)分析結(jié)果顯示，西羅莫司 Cmax為(12.66±4.1)ng/mL，t1/2為(19.2±11.2)h，tmax為(1.8±0.3)h。在5例肝移植患者使用過(guò)程中，出現(xiàn)總膽固醇升高2例，服用瑞舒伐他汀片(10 mg，1次/d口服)1個(gè)月后總膽固醇均降至正常范圍內(nèi)，其他均未出現(xiàn)異常。

4 討論

由于測(cè)定西羅莫司血藥濃度時(shí)需用全血，而全血中的血細(xì)胞及蛋白質(zhì)分子，會(huì)使萃取時(shí)發(fā)生乳化現(xiàn)象，對(duì)色譜柱分離產(chǎn)生較大的影響，因此，當(dāng)西羅莫司從血細(xì)胞及血漿蛋白中提取至溶劑時(shí)，需加入蛋白沉淀試劑，沉淀、離心，從而消除細(xì)胞及蛋白干擾。而液-液萃取法是被測(cè)組分從生物基質(zhì)中分離、純化的常用方法，它可將被測(cè)組分自大量?jī)?nèi)源性物質(zhì)中選擇性地萃取分離。本實(shí)驗(yàn)以1-氯正丁烷為萃取液，有選擇地將西羅莫司從混合液中萃取出來(lái)，然后將上層有機(jī)層(1-氯正丁烷)分離，再將萃取液揮發(fā)，最后得到濃集的被測(cè)組分。此方法簡(jiǎn)便，色譜分離效果較好，主峰易于識(shí)別，缺點(diǎn)在于提取物質(zhì)雜質(zhì)較多、回收率低，影響了其在HPLC中的應(yīng)用。

圖2 口服西羅莫司2 mg后藥-時(shí)曲線

國(guó)內(nèi)的研究表明，SRL治療窗在穩(wěn)態(tài)谷濃度4～8 ng/mL范圍內(nèi)［4-5］，而不是國(guó)外推薦應(yīng)用的10～15 ng/mL。在這個(gè)范圍內(nèi)，既能有效預(yù)防移植肝發(fā)生急性排斥反應(yīng)，又能減少其毒副作用。HPLC法測(cè)定西羅莫司的線性范圍為2.0～50 ng/mL，覆蓋SRL有效濃度范圍，但臨床監(jiān)測(cè)中發(fā)現(xiàn)個(gè)別血藥濃度＜2.0 ng/mL，超出本實(shí)驗(yàn)的線性范圍，給臨床調(diào)整給藥劑量造成一些不便。

［1］ 李冠軍，董桂青，金仲品.西羅莫司的研究進(jìn)展［J］.中國(guó)醫(yī)療前沿，2008，3(2):34-36.

［2］ 馬秋野，孫峰，武步強(qiáng)，等.肝移植術(shù)后他克莫司血藥濃度與尿α1微球蛋白及微量白蛋白的相關(guān)性研究［J］.中國(guó)普外基礎(chǔ)與臨床雜志，2006，13(3):334-335.

［3］ Watson CJ，Gimson AE，Alexander GJ，et al.A randomized controlled trial of late conversion from calcineurin inhibitor(CNI)-based to sirolimus-based immunosuppression in liver transplant recipients with impaired renal function［J］.Liver Transpl，2007，13:1694-1702.

［4］ 張曉軍，傅志仁.西羅莫司在肝移植中的臨床應(yīng)用［J］.肝膽胰外科雜志，2010，22(1):83-85.