王賀玲，張 健，李 巖，王學清

順鉑(CDDP)作為治療多種實體瘤的臨床一線用藥，是胃癌的常用化療藥物。其作用類似烷化劑，主要通過特異結合DNA，使鏈內及鏈間發(fā)生交鏈，干擾DNA復制、RNA及蛋白質的合成［1-5］。5-Aza-CdR是明確的去甲基化藥物，能與DNA甲基轉移酶共價結合，降低DNA甲基轉移酶的生物活性，以進一步使基因去甲基化，使失活基因重新表達。本文通過對低劑量順鉑與5-Aza-CdR聯(lián)合用藥，觀察兩者對胃癌細胞生長及DAPK1基因的影響，探討5-Aza-CdR是否能夠作為一線化療藥物順鉑的輔助用藥，使該藥物在較低劑量時發(fā)揮較大的作用。

1 材料與方法

1.1 材料 BGC823細胞系購自中國醫(yī)科大學細胞生物教研室，5-Aza-CdR及碘化丙啶(PI)為Sigma產(chǎn)品，順鉑(CDDP)為貴州漢方制藥有限公司產(chǎn)品。RT-PCR試劑盒購自TaKaRa公司，RPMI 1640培養(yǎng)基為Hyclone產(chǎn)品，Taq酶及dNTP均為TaKaRa公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng) CDDP與5-Aza-CdR聯(lián)合用藥對胃癌細胞的影響:胃癌BGC823、SGC7901細胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清、1%鏈霉素，青霉素的RPMI1640培養(yǎng)液于37℃、50 mL/L CO2條件下培養(yǎng)。

1.2.2 MTT檢測細胞生長活性 (1)CDDP對胃癌細胞的影響:取處理前的對數(shù)生長期的細胞，按每孔2×103(200 μL)接種于96孔板，共接種5板，每組6孔。接種24 h后去上清液，加入含CDDP(1×10－6mol/L)的培養(yǎng)液繼續(xù)放入 CO2孵箱，在37℃、5%CO2及飽和濕度下繼續(xù)培養(yǎng)，以后在24、48、72 h各時間點分別取一板，每孔加入MTT 溶液(5 mg/mL)20 μL，繼續(xù)培養(yǎng)4 h。終止培養(yǎng)，去除孔內上清液，每孔加入150 μL DMSO，震蕩10 min，選擇570 nm波長，在酶標儀上測定各孔光吸收值(A)，其增殖能力大小以平均吸光度(A)值分析。以未加CDDP干預的細胞為對照組。(2)CDDP與5-Aza-CdR聯(lián)合用藥對胃癌細胞生長的影響:將胃癌細胞傳代24 h后，加入含5-Aza-CdR(1×10－6mol/L)的培養(yǎng)液，作用 48 h后，將細胞按每孔2×103(200 μL)接種于96孔板，共接種5板，每組6孔，接種24 h后去上清液，加入含CDDP按(1×10－6mol/L)的培養(yǎng)液繼續(xù)放入CO2孵箱，在37℃、5%CO2及飽和濕度下繼續(xù)培養(yǎng)，以后在24、48、72、96、120 h 各時間點分別取一板，每孔加入MTT溶液(5 mg/mL)20 μL，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，終止培養(yǎng)，去除孔內上清液，每孔加入150 μL DMSO，震蕩10 min，選擇570 nm 波長，在酶標儀上測定各孔光吸收值(A)，其增殖能力大小以平均吸光度(A)值分析。以未加5-Aza-CdR干預的細胞為對照組。

1.2.3 半定量RT-PCR分析 DAPK1的表達:用Trizol試劑提取各組BGC823細胞總RNA，用逆轉錄酶和Oliga(dT)20引物合成cDNA。DAPK1引物序列上游引物:5'-GCCTGGAGACGGAGAAGAT-3'，下 游 引物:5'-AAGTCCCGTGGCTGGTAGA-3'，擴增長度為172 bp。以 β-actin為內參，上游引物:5'-GTGGGGCGCCCCAGGCACCA-3'，下 游 引 物:5'-CTCCTTAATGTCACGCACGATTTC-3'，擴增長度為498 bp。兩對引物均加入25 μL反應體系中，PCR反應條件:94℃變性45 s，58℃復性45 s，72℃延伸60 s，共35個循環(huán)。RT-PCR產(chǎn)物經(jīng)2%瓊脂糖膠分離，用Alpha Image 2000自動成像儀攝影，用Fluorchem V 2.0 Stand Alone軟件分析RT-PCR產(chǎn)量。

2 結果

2.1 生長曲線 從生長曲線可以看出，SGC7901細胞與BGC823細胞在5-Aza-CdR(1×10－6mol/L)的作用下生長受到一定的抑制，而在低濃度的CDDP(1×10－6mmol/L)的作用下生長為接近直線，無明顯的對數(shù)生長期，而在兩種藥物的聯(lián)合作用下，生長曲線出現(xiàn)了下降的趨勢，說明此兩種藥物的聯(lián)合有協(xié)同作用。見圖1、圖2。

圖1 SGC7901細胞在用藥前后生長曲線

2.2 DAPK1基因的mRNA的表達情況 細胞目的基因cDNA與β-actin cDNA光密度比值與對照組的兩者光密度比值進行比較，增高30% ～70%為上調，減少30% ～70%為下調。在細胞中聯(lián)合用藥組亦見明顯的該基因表達上升(與CDDP組比較)。而用藥后DAPK1基因的表達均明顯上升，尤其在聯(lián)合用藥組，2株細胞中該基因表達均明顯上升(與CDDP組比較)。見表1。

圖2 BGC823細胞在用藥前后生長曲線

表1 SGC7901細胞與BGC823細胞在用藥前后各目的基因的mRNA表達情況(目的基因光密度/β-actin)(±s)

表1 SGC7901細胞與BGC823細胞在用藥前后各目的基因的mRNA表達情況(目的基因光密度/β-actin)(±s)

注:與對照組比較，*P＜0.05;與5-Aza-CdR組比較，#P＜0.05;與 CDDP組比較，ΔP＜0.05

SGC7901細胞 DAPK1 BGC823細胞DAPK1對照組 0.221±0.024 對照組0.165±0.003 5-Aza-CdR(5×10－6 mol/L)48 h 0.524±0.008*5-Aza-CdR(1×10－6 mol/L)48 h 0.472±0.035*CDDP(5×10－6 mol/L)48 h 0.772±0.011*#CDDP(1×10－6 mol/L)48 h 0.373±0.021*聯(lián)合用藥組48 h 0.812±0.006*#Δ 聯(lián)合用藥組48 h 0.56±0.023*Δ

3 討論

胃癌化學治療的主要作用機制為誘導腫瘤細胞凋亡，誘導凋亡能力的強弱與化療敏感性密切相關，在化療基礎上輔以促進凋亡的藥物，可顯著提高胃癌的化療敏感性［6］。近年來，許多體內外研究表明，5-Aza-CdR與CDDP在腫瘤的治療上具有協(xié)同作用。研究表明，CDDP化療藥物的耐藥機制與該藥物誘導了部分基因的甲基化有關，而5-Aza-CdR是明確的去甲基化誘導劑，對細胞的凋亡均有誘導作用［7-8］。在對宮頸癌的研究中發(fā)現(xiàn)，CDDP和5-Aza-2'-deoxycytidine(5-Aza-CdR)聯(lián)合應用于ME180人類宮頸鱗狀上皮癌細胞系和6個單克隆細胞(在ME180基礎上培養(yǎng)出的具有對CDDP抵抗的次克隆ME180細胞)，明顯提高了對母系細胞和對CDDP抵抗的次克隆細胞對CDDP的敏感性。5-Aza-CdR的應用迅速逆轉了對CDDP抵抗細胞已增加的敏感性，而母細胞對CDDP敏感性的提升至少可保持24 h。相較于母系細胞，RT-PCR顯示，CDDP抵抗的次克隆表達較高的DNA甲基化轉移酶(DNMT)mRNA水平，DNMT的表達提升很容易恢復次克隆細胞(去除5-Aza-CdR后)對CDDP的抵抗。雖然母細胞顯示了DAPK啟動子區(qū)域的高甲基化，但在2個CDDP抵抗的次克隆細胞中，未發(fā)現(xiàn)相應的甲基化區(qū)域(MSP)。6株CDDP抵抗的次克隆細胞DAPK的表達均比母細胞高。對CDDP的抵抗伴隨著分子的變化，擾亂DAPK轉錄后的翻譯，這些分子變化可由去甲基化而短暫恢復［9］。在對前列腺癌的研究中，當5-Aza-2'-CdR單獨加入DU145中培養(yǎng)時，不能誘導明顯的凋亡。而與CDDP聯(lián)合用藥后，在控制DU145細胞凋亡壞死中表現(xiàn)了強大的協(xié)同作用［10］。CDDP是神經(jīng)細胞瘤的主要化療藥物。近年研究表明，在此進程中，藥物誘導的DNA甲基化扮演重要角色，而5-Aza-2'-CdR能恢復其對CDDP的敏感性［11］。在胰腺癌腫瘤發(fā)生的過程中，甲基化狀態(tài)的改變已經(jīng)被認為是一種可能的表觀遺傳學改變。由于對傳統(tǒng)藥物治療抵抗的腫瘤預后較差，在用甲基酶抑制劑5-Aza-CdR對不同胰腺癌細胞系處理后，發(fā)現(xiàn)基因廣泛的去甲基化誘導使其對各種化療藥物的敏感性增加［12］;而5-Aza-CdR亦能夠提高精母細胞瘤細胞系對CDDP的敏感性［13］。

本實驗研究了低濃度CDDP(1×10－6mol/L)對胃癌細胞的影響，發(fā)現(xiàn)其僅對胃癌細胞生長有抑制作用，與5-Aza-CdR共同作用于胃癌細胞后，發(fā)現(xiàn)細胞凋亡較單獨CDDP作用時明顯升高，表明5-Aza-CdR能夠增加胃癌細胞對低濃度CDDP的敏感性。

腫瘤細胞凋亡受眾多凋亡相關基因調控，DAPK1基因即死亡相關蛋白激酶-1(Death-associated protein kinase-1)也是一種調節(jié)細胞凋亡的正調控因子。研究表明，DAPK1作為一種細胞凋亡的正性調節(jié)因子，其表達低下或缺失與胃癌的發(fā)生發(fā)展密切相關;檢測DAPK1蛋白可以作為判斷胃癌細胞的分化程度及腫瘤類型的新的分子生物學指標，為臨床診斷、治療提供新的靶點［14-16］。許多研究亦證實，該基因在胃癌中的高甲基化狀態(tài)與該基因的表達下降有明顯的關系［17］。在聯(lián)用5-Aza-CdR與5-FU、PTX、OXA等藥物的體外實驗中亦發(fā)現(xiàn)，胃癌細胞對化療藥物的敏感性提高與DAPK表達有關［18］。從本實驗結果亦可以看出，在胃癌細胞中，DAPK基因在5-Aza-CdR增加CDDP藥敏性方面起到重要作用?？紤]此兩種藥物的協(xié)同作用與細胞凋亡基因的表達增加有關，兩種藥物與目的基因去甲基化，使其表達逆轉，從而進一步增加CDDP對腫瘤細胞的作用。

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