朱少平，趙金平，毛志福，黃 杰，王君鈺，周雪峰，徐 明

肺動脈平滑肌細(xì)胞(PASMCs)異常增殖是肺動脈高壓(PAH)的常見病理特征，其直接后果是導(dǎo)致肺動脈分支狹窄甚至閉塞，肺循環(huán)阻力增高［1］。PAH患者和動物模型中5-羥色胺(Serotonin，5-hydroxytryptamine，5-HT)異常增高，是觸發(fā)PAH的重要因素之一，其在PAH的病理發(fā)生和演變過程中擔(dān)當(dāng)著不可忽視的角色。5-HT是一種肺血管收縮劑和促有絲分裂劑，其促有絲分裂效應(yīng)的實現(xiàn)主要依賴于一種與其具有高親和力的5-HT轉(zhuǎn)運體(5-HT transporter，5-HTT)。有研究表明，5-HTT抑制劑能逆轉(zhuǎn)野百合堿誘導(dǎo)的大鼠PAH［2］，提示5-HTT的活性與PAH動物模型中肺血管重構(gòu)密切相關(guān)。本研究擬通過觀察5-HTT抑制劑氟西汀對離體PASMC體外增殖的影響，以期為5-HTT抑制劑治療PAH提供一定的理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實驗材料 Wistar大鼠(二級雄性，7周齡，湖北省實驗動物中心提供)。氟西汀(Fluoxetine，Sigma，美國)，野百合堿(MCT，Sigma)，小牛血清(杭州四季青生物工程有限公司)，胰蛋白酶(Sigma)。酶標(biāo)儀(BIO-TEK，美國)，流式細(xì)胞儀(貝克曼庫爾特，美國)，高速離心機(jī)(金壇市醫(yī)療儀器廠，中國)，凝膠成像分析系統(tǒng)(UVP，美國)

1.2 方法

1.2.1 大鼠PASMCs制備與分組 大鼠PASMC原代分離、培養(yǎng)方法采用組織塊貼壁法［3］，50 mL培養(yǎng)瓶常規(guī)細(xì)胞培養(yǎng)PASMC至亞融合狀態(tài)，0.5 mL 0.25%的胰蛋白酶消化，顯微鏡下觀察細(xì)胞部分脫壁時，即加含有10%小牛血清的培養(yǎng)基終止消化，吹打制成單細(xì)胞懸液，以血細(xì)胞計數(shù)板計數(shù)細(xì)胞，調(diào)整PASMC懸液濃度為1×104/mL，以每孔100 μL接種于96孔培養(yǎng)板，待細(xì)胞貼壁生長后，棄原培養(yǎng)液，PBS洗2次后分組(見表1)。

表1 實驗分組設(shè)計

5-HT+Flu組另分為5 個亞組:A、B、C、D、E，各亞組中分別加入 Flu終濃度為 5、10、20、40、80 μg/mL的培養(yǎng)液100μL，每組設(shè)6個復(fù)孔，連續(xù)培養(yǎng)24、48、72 h，根據(jù)細(xì)胞生長情況，每24 ～48 h 左右換培養(yǎng)液1次。

1.2.2 抗平滑肌肌動蛋白α-actin免疫細(xì)胞化學(xué)染色 將平滑肌細(xì)胞制成細(xì)胞爬片后，冷丙酮固定10 min，PBS沖洗3遍，后續(xù)操作依照鏈霉菌抗生物素蛋白-過氧化酶連接法(S-P法)試劑盒進(jìn)行。

1.2.3 MTT比色法細(xì)胞數(shù)目測定 在96孔平底細(xì)胞培養(yǎng)板接種濃度約為1×104/mL的PASMC，100 μL/孔，用含10%胎牛血清的DMEM補到200 μL，在常規(guī)條件下培養(yǎng)24 h(37℃，5%CO2)后，換無血清的DMEM培養(yǎng)基，同步化24 h后，分別于 24、48、72 h 每孔加入20 μL MTT 溶液;將培養(yǎng)板移入37℃、5%CO2及飽和濕度的溫箱內(nèi)靜置5 h，棄培養(yǎng)液，然后每孔加100 μL預(yù)先配制的DMSO溶液，微振蕩器上振蕩10 min混勻，繼續(xù)培養(yǎng)3 h，使MTT結(jié)晶完全溶解，用酶標(biāo)儀測定490 nm波長處各孔的吸光度值A(chǔ)490，取各復(fù)孔A490值的平均值作為統(tǒng)計數(shù)據(jù)。

1.2.4 流式細(xì)胞儀檢測(FCM) 選擇第4～6代生長良好的大鼠PASMC，按1×104/mL的濃度接種入6孔平底塑料培養(yǎng)板，將培養(yǎng)液換為無血清的DMEM培養(yǎng)24 h(37℃，5%CO2)，使細(xì)胞同步化后，分別于 48、72 h消化收集各組細(xì)胞，1 000 r/min離心5 min，PBS漂洗，過濾，調(diào)整單細(xì)胞懸液濃度為1×106/mL;1 000 r/min離心5 min，PBS漂洗，200目濾網(wǎng)過濾，調(diào)整單細(xì)胞懸液濃度為1×106/mL，離心，棄上清液;PBS漂洗2次，每管加入70%預(yù)冷乙醇1.5 mL固定，并用Tip頭輕輕混勻，－20℃固定過夜后離心棄乙醇，用PBS洗滌2次;留取細(xì)胞懸液 50 μL，加入終濃度為1 mg/mL的 RNase 100 μL，于37 ℃水浴30 min，立即置于冰水浴中;加入終濃度為500 μg/mL的PI染液50 μL，避光染色30 min，4 h內(nèi)轉(zhuǎn)入 FCM 測量管上流式細(xì)胞儀檢測。

1.2.5 統(tǒng)計分析 采用SPSS 13.0統(tǒng)計分析軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析，組間比較采用方差分析，兩組間比較采用t檢驗，P＜0.05認(rèn)為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 顯微鏡下觀察 在倒置光學(xué)顯微鏡下，大鼠PASMC呈梭型，細(xì)胞中心有深染的卵圓形細(xì)胞核(見圖1)，細(xì)胞生長呈現(xiàn)出分布不均勻的“峰－谷”樣特征。免疫組化S-P法做α-actin抗體免疫組化染色，可見細(xì)胞胞漿中呈現(xiàn)棕色深染顆粒(見圖2)。

圖1 傳代培養(yǎng)的PASMC，呈現(xiàn)典型“峰-谷”特征(箭頭)(HE×100)

圖2 PASMC α-actin陽性表達(dá)(箭頭)(SP×400)

2.2 各組PASMC細(xì)胞周期分析結(jié)果比較 FCM細(xì)胞周期分析結(jié)果表明，各組細(xì)胞培養(yǎng)48 h后，5-HT組細(xì)胞S期細(xì)胞比例［(43.36±1.04)%］較Control組［(24.76±1.02)%］明顯上升，G0/G1期細(xì)胞比例［(51.54±1.13)%］較 Control組［(69.35±1.04)%］明顯下降(P＜0.01)。Flu組(Flu濃度為10 μg/mL)48 h后與Control組比較，二者在G0/G1期、S期細(xì)胞百分?jǐn)?shù)上差異無統(tǒng)計學(xué)意義。48 h后，5-HT+Flu組與5-HT組PASMC細(xì)胞周期分布情況比較，G0/G1期細(xì)胞比例較Control組明顯上升，而S期細(xì)胞比例較Control組明顯下降(P＜0.01)，5-HT+Flu組與Control組對應(yīng)值比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)(見表2)。

表2 培養(yǎng)72 h后各組對PASMC細(xì)胞周期的影響(n=6)

2.3 不同濃度Flu對PASMC增殖的影響 5-HT組(Flu 0 μg/mL)細(xì)胞培養(yǎng)48 h后，A490值較 Control組明顯增加，至72 h時，兩組比較，P＜0.01。PASMC培養(yǎng)24 h后，未觀察到不同F(xiàn)lu濃度組之間A490值差異存在統(tǒng)計學(xué)意義。48 h后，F(xiàn)lu濃度為20 μg/mL時，該組 A490值較5-HT組顯著降低(P＜0.05)，且隨著Flu濃度遞增，A490值進(jìn)一步下降，當(dāng)Flu濃度為80 μg/mL時，該組A490值與5-HT組對應(yīng)值比較，P＜0.01，至72 h末，上述變化趨勢更明顯(見表3)。

表3 不同濃度Flu在各時間點對PASMC增殖(A490)的影響

3 討論

5-HT對肺動脈具有強(qiáng)大的促收縮功能，目前研究表明，5-HT在PAH肺血管重構(gòu)中擔(dān)當(dāng)重要角色，其機(jī)制之一為促進(jìn)平滑肌細(xì)胞遷移和增生［4］。PAH患者血液中5-HT水平高于正常，已得到多數(shù)實驗結(jié)果的證實［5-7］，提示5-HT與人類PAH的病理發(fā)生過程密切相關(guān)。

本實驗中采用5-HT對體外培養(yǎng)的PASMC細(xì)胞進(jìn)行干預(yù)，48 h該組細(xì)胞A490值與空白對照組相比顯著升高，而Flu及5-HT+Flu組細(xì)胞此時未觀察到這一現(xiàn)象，提示5-HT在體外對PASMC具有明顯的刺激作用。5-HT+Flu組細(xì)胞在給予5-HT刺激的同時，分別給予濃度范圍5～80 μg/mL的氟西汀干預(yù)，通過比較不同時間和不同F(xiàn)lu濃度的PASMC A490值，隨著濃度的增高或時間的延長，A490較對照組逐漸降低，提示氟西汀對體外5-HT刺激所致的PASMC增殖的抑制作用具有濃度依賴性。細(xì)胞周期分析顯示，氟西汀作用于PASMC 72 h后，細(xì)胞周期分布表現(xiàn)為S期細(xì)胞比例下降，G0/G1期細(xì)胞比例上升，提示氟西汀抑制PASMC增殖主要是通過抑制DNA復(fù)制實現(xiàn)的。

長期服用食欲抑制劑可以拮抗5-HTT，從而使血漿及下丘腦5-HT水平增加。既往研究表明，該作用與PAH危險性增加有關(guān)［8-9］。19世紀(jì)30年代，食欲抑制劑延胡索酸的應(yīng)用使歐洲PAH患病人群明顯增加，隨后，類似藥物如右旋酚氟拉明的應(yīng)用同樣被證實與PAH發(fā)病增加有關(guān)［10］。然而，其他藥物如選擇性5-羥色胺重攝取抑制劑雖然增加血漿5-HT水平，但似乎并未增加PAH發(fā)病的危險性［11］，提示尚有其他未知因素參與PAH的病理過程。

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