張永強，張 維，王清華，吳研功，趙云玲，趙永剛，王志亮

（中國動物衛(wèi)生與流行病學(xué)中心 國家外來動物疫病診斷中心，山東 青島 266032）

近年來，我國部分地區(qū)肉牛發(fā)生以壞死性肺炎為主要特征的呼吸道傳染病，病牛出現(xiàn)咳嗽，食欲不振，消瘦等癥狀，有的病牛出現(xiàn)繼發(fā)性關(guān)節(jié)炎或腹瀉[1-2]。本實驗室對山東某一牛交易市場部分牛群進行鼻腔棉拭子采樣，采用PCR方法對引起牛發(fā)生類似癥狀的主要支原體進行了檢測。

1 材料與方法

1.1 樣品采集

64份鼻腔棉拭子樣品,采自山東某地一牛交易市場，該交易市場牛出現(xiàn)不明原因的發(fā)熱、咳嗽等臨床癥狀為主的傳染性疫病。

1.2 酶、試劑和主要儀器

病毒RNA提取試劑盒、逆轉(zhuǎn)錄酶為羅氏公司產(chǎn)品；Taq DNA聚合酶、T4 DNA連接酶、pMD18-T載體以及限制性內(nèi)切酶均購自大連寶生物公司；DNA純化試劑盒SpinPrep Gel DNA Kit為Novagen公司產(chǎn)品；其他為國產(chǎn)分析純試劑。

1.3 方法

1.3.1 引物

根據(jù)NCBI上公布的支原體16S rRNA核酸序列，針對牛常見致病支原體，用Primer Premier 5.00軟件設(shè)計5對引物（表1）。

1.3.2 RNA提取

按羅氏公司RNA提取試劑盒進行。

1.3.3 RT-PCR反應(yīng)

以上述提取的總RNA做模板，對牛羊主要致病性支原體檢測陽性的樣品，分別用引物P1、P2、P3、P4、P5進行差異脲原體、牛支原體、牛生殖道支原體、牛眼支原體和絲狀支原體絲狀亞種（SC型）RT-PCR檢測，將擴增產(chǎn)物克隆至質(zhì)粒pMD18-T載體（寶生物工程大連有限公司），交由上海生工進行序列測定。

RT-PCR 反應(yīng)體系為 25μL，模板 3μL，10×Buffer 2.5μL，dNTP 2μL，r-taq 0.6μL，HPR-I 0.5μL，MLV 0.25μL，上游引物（20 μ M）1μL，下游引物（20 μ M）1μL，Rnase free H2O 14.15μL。

反應(yīng)程序：首先42℃40 min；接著95℃變性3 min；然后 94 ℃ 30 s，55 ℃ 40 s，72 ℃ 40 s，35 個循環(huán)；最后72℃延伸7 min。

表1 引物序列

2 結(jié)果與分析

2.1 牛支原體檢測結(jié)果

對牛羊主要致病性支原體檢測陽性的樣品，進行牛支原體（P2）PCR 檢測，陽性樣品為 17、28、30、33、36、39、42（圖 1）。

2.2 其他支原體檢測結(jié)果

應(yīng)用引物P1、P3、P4、P5對待檢樣品進行差異脲原體、牛生殖道支原體、牛眼支原體和絲狀支原體絲狀亞種（SC型）病原檢測，結(jié)果均為陰性。

2.3 序列比對結(jié)果

將牛支原體PCR陽性產(chǎn)物克隆到pMD18-T進行測序并進行序列分析，利用BLAST軟件進行序列同源性比較。結(jié)果顯示，與GenBank中牛支原體（Mycoplasma bovis）16SrRNA 序列（GenBank登錄號：AF332754）同源性為99%以上，因牛支原體屬于無乳支原體的一個亞種，因此與無乳支原體（Mycoplasma agalactiae）也具有很高的同源性。對測序結(jié)果進行遺傳進化樹分析，結(jié)果顯示，相比無乳支原體而言，所測序列，與牛支原體有更近的遺傳距離（圖2）。說明引起本次部分牛發(fā)病的病原可能是牛支原體。

3 討論

牛支原體最早在1961年被鑒定為致乳腺炎的病原[4]，現(xiàn)在被認(rèn)為是育肥牛、青年奶牛與犢牛呼吸道疾病與多發(fā)性關(guān)節(jié)炎的重要病因。牛支原體除了導(dǎo)致牛急性呼吸系統(tǒng)疾病外，還可導(dǎo)致持續(xù)性的慢性感染，以慢性支氣管炎伴有肺干酪樣或凝固性壞死病變?yōu)橹?。牛支原體常與細(xì)菌、病毒協(xié)同作用，環(huán)境因子如天氣、通風(fēng)不良、過度擁擠、運輸?shù)葘⒓觿〔∏閇5]。

患有牛支原體的病牛可通過鼻腔分泌物排出牛支原體，健康?？赏ㄟ^近距離接觸病牛而感染發(fā)病。牛支原體在環(huán)境中存活力差，但在無陽光情況下可存活數(shù)天，如4℃下可在海綿中或牛奶中存活2個月，或水中存活2周以上；20℃存活1～2周，或37℃存活1周。糞便中可存活37天[6]。常規(guī)消毒劑均可達到消毒目的。

本實驗設(shè)計多對引物，采樣PCR方法對臨床采集的棉拭子樣品進行了牛支原體、差異脲原體、牛生殖道支原體、牛眼支原體和牛傳染性胸膜肺炎（CBPP）的病原學(xué)檢測，對PCR產(chǎn)物進行測序，將序列與NCBI上進行比對證明所得序列與牛支原體和無乳支原體都具有很高的同源性。隨后，將所得序列與牛羊主要致病支原體進行遺傳進化分析，證明得到的核酸序列與牛支原體具有更近的遺傳進化關(guān)系，從而更加確鑿的證明了本次引起牛發(fā)病的病原是牛支原體。

[1]石磊，龔瑞，尹爭艷，等.肉牛傳染性支原體肺炎流行的診斷[J]. 華中農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報，2008，27（5）：629-633.

[2]辛九慶.牛傳染性胸膜肺炎診斷技術(shù)與分子流行病學(xué)研究[D].長春：吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，2007.

[3]陳繼明.重大動物疫病監(jiān)測指南[M].北京：中國農(nóng)業(yè)科學(xué)技術(shù)出版社，2008.

[4]HALE H H，HEMBOLDT C F，PLASTRIDGE W N.Bovine mastitis caused by a Mycoplasma species[J].Cornell Veterinarian，1962，52：582-591.

[5]CASWELLJL，ARCHAMBAULTM.Mycoplasma bovis pneumonia in cattle[J].Anim Health Rev，2007，8（2）：161-186.

[6]王桂芝.動物霉形體及研究方法 [M].北京：中國農(nóng)業(yè)出版社，1998.