官國英,李麗波,劉忠瑞,許文革,韓世泉

(中國原子能科學(xué)研究院同位素研究所,北京 102413)

3,5,3'-三碘甲腺原氨酸(T3)是甲狀腺分泌的激素之一,相對分子質(zhì)量為651。血液循環(huán)中的T3除小部分由甲狀腺組織直接釋放外,大部分由甲狀腺素(T4)在組織中脫碘轉(zhuǎn)化而來。T3與T4同受下丘腦-腦垂體-甲狀腺軸的調(diào)節(jié),并協(xié)同維持正常穩(wěn)定的甲狀腺功能,在機(jī)體的生長、發(fā)育、代謝及全身激素的平衡中起著重要的調(diào)節(jié)作用。

T3是診斷甲亢最靈敏的指標(biāo)之一,它可以特異性地反映甲狀腺的功能狀態(tài),對判斷甲狀腺功能紊亂有較高的應(yīng)用價值[1-2]。目前臨床檢測T3的方法主要有放射免疫分析(RIA)、酶免疫分析(EIA)、熒光免疫分析(FIA)和化學(xué)發(fā)光免疫(CLIA)。EIA具有靈敏度高、檢測范圍寬、操作簡便快速、標(biāo)記物穩(wěn)定性好、儀器簡單經(jīng)濟(jì)等優(yōu)點,是目前免疫分析理想的方法之一。

1 實驗材料

1.1 主要儀器

酶標(biāo)儀:奧地利SLT公司產(chǎn)品;GAMMAC12γ計數(shù)器:DPC公司產(chǎn)品;Cary 50 Probe紫外分光檢測儀:美國Varian公司產(chǎn)品;電熱培養(yǎng)箱:上海躍進(jìn)醫(yī)療器械廠產(chǎn)品。

1.2 主要試劑

T3、生物素化試劑、鏈親合素化酶、四甲基聯(lián)苯胺(TMB)、脲素過氧化氫(H 2O2):均為美國Sigma公司產(chǎn)品,T3抗體、T 3-RIA(PR)試劑盒:原子高科股份有限公司產(chǎn)品。

2 實驗方法

2.1 T3生物素化[3-4]

取T3鈉鹽用0.1 mol/L NaHCO3配制成1 g/L,在1 mL溶液中加入溶于30μL 20 g/L二甲基甲酰胺的生物素-N-羥基琥珀酰亞胺脂(BNHS)溶液,混勻,室溫反應(yīng) 1.5 h,用0.2 mol/L p H 7.4 PBS調(diào)pH為7.4,加入等體積甘油,-20℃貯存?zhèn)溆谩?/p>

2.2 固相抗體的制備

向聚苯乙烯微量滴定板孔中按每孔100μL加入含有 T3抗體的 p H 9.6碳酸緩沖液,置4℃冰箱內(nèi)過夜,37℃封閉1 h。此酶標(biāo)板可用于免疫反應(yīng)。

2.3 T3標(biāo)準(zhǔn)品的配制

稱取0.5 mg T3,用0.1 mol/L NaOH溶液完全溶解,用紫外分光光度法測定其含量;用去激素血清對其進(jìn)行稀釋,配制成0.5、1.0、2.0、4.0、8.0μg/L的系列標(biāo)準(zhǔn)品。標(biāo)準(zhǔn)品經(jīng) T3-RIA校準(zhǔn),分裝,4℃貯存?zhèn)溆谩?/p>

2.4 底物溶液和終止劑

將TMB和H 2O2分別溶于p H 5.0的檸檬酸-磷酸緩沖液中,控制其濃度分別為 0.6、1.2 mmol/L,使用時以體積比1∶1混合即為底物溶液。終止劑為2 mol/L H 2SO4溶液。

2.5 T3-生物素-ELISA(T3-BA-ELISA)分析程序

采取二步法加樣程序:將50μL待測樣品或標(biāo)準(zhǔn)品和50μL生物素化T3加入包被有T3抗體的微量滴定板中,混勻,37℃溫育1 h,棄反應(yīng)液,用洗滌液(含0.05%Tween-20)洗5次,以每孔100μL加入鏈親合素化酶工作液,37℃溫育0.5 h;棄反應(yīng)液,用洗滌液洗 5次,按每孔100μL加入底物液。避光,在 37℃下顯色15 min,用2 mol/L H 2SO4溶液按每孔50μL終止顯色。采用酶標(biāo)儀于450 nm處測定其光密度OD450。繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,計算樣品中T 3含量。

3 結(jié)果與討論

3.1 方法學(xué)建立

3.1.1 T3-BA-ELISA和T3-EIA的比較 T3-BA-ELISA和T3-EIA兩種實驗方案的標(biāo)準(zhǔn)曲線示于圖1。圖1顯示,T3-BA-ELISA系統(tǒng)抑制曲線好,能更好地滿足免疫分析要求。

圖1 T3-ELISA與T3-BA-ELISA的比較□——T 3-ELISA;●——T3-BA-ELISA

3.1.2 T 3抗體包被濃度的選擇 用p H 9.6的Na2CO3-NaHCO3緩沖液將T3抗體配制成0.5、1.0、2.0、3.0 、5.0、10.0、15.0、20.0 mg/L 工作液包被微孔,制備包被微孔板,用于 T3-BAELISA,實驗結(jié)果示于圖2。圖2顯示,包被濃度為10 mg/L時,標(biāo)準(zhǔn)點0.5、8.0μg/L與對應(yīng)的0標(biāo)準(zhǔn)點的OD 450之比較大,抑制效果較好,可以滿足免疫分析要求。

3.1.3 生物素化T3(T3-B)結(jié)合物的選擇 采用不同的投料比(摩爾比)制備出3種 T3-B∶T3-B1(1∶1)、T3-B2(1∶1.5)和 T3-B3(1∶2),將這3種T3-B用于T3-BA-ELISA,結(jié)果示于圖3。圖3顯示,T3-B3的0.5、4.0、8.0 μg/L 與對應(yīng)的0μg/L的OD450之比較大,抑制效果較好,能滿足免疫分析要求。

圖2 抗體包被濃度□——0;●——0.5 μg/L;▲——8.0 μg/L

圖3 T 3-B結(jié)合物的選擇□— —0;●— —0.5 μg/L;▲— —4.0 μg/L;◆— —8.0 μg/L

3.2 方法學(xué)鑒定

3.2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線與靈敏度 按照 T3-BAELISA分析程序進(jìn)行實驗,以標(biāo)準(zhǔn)品的濃度為橫坐標(biāo)(對數(shù)坐標(biāo)),OD450為縱坐標(biāo)(普通坐標(biāo)),在半對數(shù)坐標(biāo)紙上繪出 T3-BA-ELISA標(biāo)準(zhǔn)曲線,結(jié)果示于圖 4。同時測定20個零標(biāo)準(zhǔn)的OD450,以其平均值減去2s計算其分析靈敏度為0.2μg/L。

3.2.2 精密度 重復(fù)測定3份含有不同T3濃度的人血清樣品,觀察批內(nèi)、批間變異,結(jié)果列于表1。表 1顯示,批內(nèi)變異為7.1%～8.3%,批間變異為6.5%～10.5%,符合免疫分析要求。

圖4 T 3-BA-ELISA標(biāo)準(zhǔn)曲線

表1 T3-BA-ELISA試劑盒的批內(nèi)、批間變異

3.2.3 準(zhǔn)確性 取3份不同T3濃度的血清樣品分別加入已知濃度的 T3標(biāo)準(zhǔn)品中,測定T3回收率,結(jié)果列于表 2。表 2顯示,回收率為98.1%～107.2%。該結(jié)果符合免疫分析要求。3.2.4 健全性實驗 取T 3含量較高的人血清樣品用T3“零”血清進(jìn)行倍比稀釋,并將其作為樣品用于T3-BA-ELISA,結(jié)果示于圖5。

表2 T 3-BA-ELISA回收實驗

圖5 T 3-BA-ELISA樣品稀釋實驗

對圖5數(shù)據(jù)進(jìn)行線性擬合,相關(guān)方程為y=5.62x+0.18,相關(guān)系數(shù) r=0.995 7,該結(jié)果符合免疫分析要求。

3.3 穩(wěn)定性實驗

將T3-BA-ELISA整體試劑盒分別于37℃下放置15、12、8、3 d,將各考驗時間的整體試劑盒與4℃下存放的試劑盒同時用于 T3-BAELISA,結(jié)果示于圖6。利用該試劑盒同時檢測低、中、高濃度3份血清樣品中 T3的含量,結(jié)果列于表3。圖6顯示,整體試劑盒分別于37℃下放置15、12、8、3 d與 4℃下保存的試劑盒對照,標(biāo)準(zhǔn)點OD450無顯著性差異。表3顯示,整體試劑盒在37℃下存放相同時間與4℃對照,3份血清樣品的測量值無顯著性差異。以上結(jié)果說明本工作所制得的試劑盒在37℃下的穩(wěn)定性滿足免疫分析要求。

圖6 整體試劑盒的穩(wěn)定性□— —0;●— —0.5 μg/L;▲— —4.0 μg/L;▼— —8.0 μg/L

3.5 正常參考值

測定78例健康體檢人血清樣品,正常參考值范圍為0.9～2.2μg/L,與文獻(xiàn)[5]結(jié)果基本一致。

表3 整體試劑盒37℃不同時間的血樣測量值

4 小 結(jié)

本試劑盒通過方法學(xué)比較,引入生物素-親合素系統(tǒng),在抗體包被條件、生物素化試劑的選擇等方面進(jìn)行了探索,找到了合適的免疫反應(yīng)體系,完成了T 3-BA-ELISA試劑盒的研制工作。

[1] 王坤,李廣宙,王懷全.甲亢患者131I治療前后血清性激素水平觀察[J].國外醫(yī)療,2009,23:6-7.

[2] 崔素珍,韓世泉,官國英,等.游離三碘甲腺原氨酸(FT3)生物素-親合素酶聯(lián)免疫分析[J].同位素,2004,17(1):39-42.

[3] 官國英,韓世泉,王玉肖,等.高靈敏度人促甲狀腺激素(hTSH)酶聯(lián)免疫分析試劑盒[J].原子能科學(xué)技術(shù),2002,36(2):129-133.

[4] Diamandis EP,Christopouls TK.The biotin-(Strept)avidin system:principles and applications in biotechnology[J].Clin Chem, 1991, 37:625-636.

[5] 蔡錫麟,陳耀華,秦明秀,等.臨床放射免疫學(xué)[M].北京:原子能出版社,1994:135.