盧 霞,王榮福,閆 平,周穎明,張一帆

(1.北京大學第一醫(yī)院 核醫(yī)學科,北京 100034;2.上海交通大學醫(yī)學院附屬瑞金醫(yī)院 眼科,上海 200025)

甲狀腺相關眼病(Thyroid Associated Ophthalmophy,TAO),又稱“Graves眼病”,是甲狀腺疾病引發(fā)的最常見的眼眶病變之一,嚴重時可導致患者失明。目前臨床上還缺乏行之有效的Graves眼病的治療方法。在Graves眼病活動期,球后組織浸潤的淋巴細胞和活化的成纖維細胞表達生長抑素受體(Somatostatin Receptor,SSTR),其數(shù)量與炎癥活動度呈正相關[1-3]。[Tyr3]octreotide是人工合成的含八個氨基酸多肽的生長抑素類似物(SSA),被131I標記后與生長抑素受體亞型 SSTR2、SSTR5有高親和力,在惡性腫瘤臨床顯像方面已獲得成功[4]。但關于炎癥細胞對放射性核素標記octreotide的攝取情況還未見報道。

關于131I標記octreotide已有很多報道,并且標記率較高。標記物多用于腫瘤顯像及治療研究。由于131I能夠發(fā)射β射線,對細胞造成非特異的殺傷作用。本工作擬采用已對octreotide進行結構修飾后形成的[Tyr3]octreotide進行131I標記,并考察標記物體外結合炎癥細胞的能力,初步探討其應用于Graves眼病診療的可行性。

1 主要實驗材料

1.1 主要試劑

[Tyr3]octreotide的合成:由北京中科亞光生物科技有限公司在Apex 396全自動多肽合成儀上采用固相合成法合成,合成的粗提物經(jīng)高效液相色譜法(HPLC)分離純化,純度達到99%,其化學結構示于圖1。

無載體131I-NaI:原子高科股份有限公司產(chǎn)品;氯胺 T(Ch2T):純度 ＞98%,Aldrich Chemical公司產(chǎn)品;Sephadex G-10:Pharmacia Biotech公司產(chǎn)品;胎牛血清:購自GIBCO生物制劑公司。其他試劑均為分析純,購自北京化學試劑公司。

1.2 細胞

圖1 [Tyr3]octreotide的結構

HUVEC血管細胞株、內皮細胞培養(yǎng)基ECM:購自裕恒豐生物科技有限公司;IL-6細胞因子:北京譜京康利科技有限公司產(chǎn)品;T淋巴細胞、成纖維細胞(NIH3T3)及小鼠脂肪細胞(3T3L1)、RPMI-1640及高糖/DMEM 培養(yǎng)基:購自南京凱基生物科技有限公司。

2 實驗方法

2.1 [Tyr3]octreotide的131I標記

2.2.1 氯胺T法

在阿賁道夫管內依次加入51μL 0.05 mol/L pH=7.5的磷酸鹽緩沖液(PBS)和20μL[Tyr3]-octreotide(溶于0.05 mol/L PBS溶液中),再加入20μL 37 MBq Na131I,隨即加入9μL氯胺 T(溶于0.05 mol/L PBS中),總反應體積為100μL,震搖3 min,加入0.1 mL 10%的人血清白蛋白中止反應?；靹?0 s,加入1.85 mL NH4 HAc混勻,待測。

采用紙層析法測定131I-[Tyr3]octreotide標記率,展開劑為V(甲醇)∶V(水)=1∶3。用Sephadex G10柱對標記液進行純化,0.05 mol/L磷酸緩沖液(PB)洗脫,按每管0.5 mL收集淋洗液,用γ計數(shù)儀測每管的放射性計數(shù),用于細胞結合實驗。

2.2.2 Iodogen法

取1個 Iodogen(150μg)涂管,依次向其中加入 20 μg[Tyr3]octreotide,37 MBq Na131I,用0.05 mol/L p H=7.4的PB補足至65μL,在旋渦混合器上輕輕振蕩反應15 min,此后加入100 μL 0.05 mol/L pH=7.4的 PB,混勻。

標記率的測定及標記物的純化方法同2.2.1節(jié)。

2.3 炎癥細胞對131I-[Tyr3]octreotide的攝取

2.3.1 細胞培養(yǎng) 在ECM培養(yǎng)基中添加內皮生長因子、5%胎牛血清及青霉素和鏈霉素后,將HUVEC血管細胞株培養(yǎng)于ECM培養(yǎng)基中;在RPMI-1640培養(yǎng)基中添加10%胎牛血清后用于培養(yǎng)懸浮的 T淋巴細胞;用高糖/DMEM(含10%胎牛血清)培養(yǎng)基培養(yǎng)貼壁生長的成纖維細胞及脂肪細胞。

2.3.2 細胞攝取實驗 待細胞長至80%,生長狀態(tài)良好后鋪于24孔板上,細胞數(shù)量約為3×104,培養(yǎng) 24 h后,向每孔內加入37 kBq131I-[Tyr3]octreotide,在不同時間點分別測定培養(yǎng)液和細胞的放射性計數(shù),計算不同時間點不同細胞對131I-[Tyr3]octreotide的攝取率。攝取率=細胞中的放射性計數(shù)/(培養(yǎng)液與細胞放射性總和)×100%。

2.4 數(shù)據(jù)處理

3 結果與討論

3.1 [Tyr3]octreotide的131 I標記結果

采用氯胺T法進行[Tyr3]octreotide的131I,標記率最高達85%。

采用Iodogen法進行[Tyr3]octreotide的131I,標記率為76%。實驗中,用 0.05 mol/L的PB溶解[Tyr3]octreotide,與乙酸相比,標記率無明顯變化。相比之下,用氯胺T法能得到較高的標記率,因此,選擇用氯胺T法進行標記。

3.2 氯胺T法標記條件優(yōu)化

3.2.1 氯胺T用量對標記率的影響

按照2.2.1節(jié)的標記方法,其他反應條件不變,[Tyr3]-octreotide的用量選擇1.4μg,改變氯胺 T 的用量(1.6、90、180、270和 360 μg),觀察其對標記率的影響,結果示于圖2。由圖2可以看出,隨氯胺T用量的增加,標記率呈現(xiàn)降低的趨勢,氯胺T用量為1.6μg時標記率最高,達到85%。氯胺T的用量增加到90μg后,標記率已很低。這是由于氯胺 T是一種性質溫和的氧化劑,用量過大會導致蛋白質結構和活性的嚴重損傷,但并不能使標記率明顯提高,反而使標記多肽的活性下降。某些多肽對氯胺 T較敏感,在標記反應中需要進一步減少氯胺T用量。本工作選擇氯胺T用量為1.6μg[5]。

3.2.2 [Tyr3]-octreotide用量對標記率的影響

按照2.2.1節(jié)的標記方法,其他反應條件不變,氯胺T用量選擇 1.6μg,改變[Tyr3]-octreotide的用量分別為1.4、8和50μg,觀察其對標記率的影響,結果示于圖3。圖3顯示,隨著[Tyr3]-octreotide用量的增加,標記率明顯降低,[Tyr3]-octreotide的用量為1.4μg時,標記率最高,為85%。本工作選擇[Tyr3]-octreotide的用量為1.4μg,與其他多肽氯胺 T法碘標記相比,[Tyr3]-octreotide用量已很小,標記率較高,與文獻[5]結果一致。影響蛋白質、多肽標記率的因素,主要決定于蛋白質、多肽分子中酪氨酸殘基的數(shù)量及它們在分子中暴露的程度。酪氨酸位于[Tyr3]-octreotide環(huán)狀結構內,考慮是由于空間結構之間的阻力使其不容易被放射性核素碘標記。明確的原因還有待于進一步研究。

圖2 氯胺T用量對標記率的影響

圖3 [Tyr3]-octreotide用量對標記率的影響

3.3 131I-[Tyr3]octreotide的細胞攝取

在不同時間點,血管細胞、脂肪細胞、T淋巴細胞及成纖維細胞對131I-[Tyr3]octreotide的攝取示于圖4。由圖4可以看出,血管細胞、T淋巴細胞及成纖維細胞中均有一定量131I-[Tyr3]octreotide的攝取,相對于血管細胞比較穩(wěn)定的攝取而言,T淋巴細胞攝取131I-[Tyr3]octreotide較多,在3 h攝取量達到最大值?；罨某衫w維細胞也有明顯的攝取,其攝取量在6 h達到最大值。脂肪細胞攝取131I-[Tyr3]octreotide較少,未出現(xiàn)明顯的峰值。

一般認為,Graves眼病的病理改變包括多種炎癥因子參與的眶周組織的水腫,T淋巴細胞的浸潤,活化成纖維細胞產(chǎn)生大量的葡萄糖胺聚糖,刺激脂肪細胞和肌肉組織的增生,產(chǎn)生突眼癥狀[6]。T淋巴細胞和活化的成纖維細胞在Graves眼病的發(fā)病機制中起重要作用[7]。它們可以大量攝取131I-[Tyr3]octreotide,考慮是因為131I-[Tyr3]octreotide與活化成纖維細胞上表達的生長抑素受體大量結合,而脂肪細胞較少表達生長抑素受體,故131I-[Tyr3]octreotide攝取較少。由于Graves眼病是一種器官自身免疫反應過程,在其發(fā)生和發(fā)展過程中有許多細胞因子也參與并起著重要作用。其中,IL-6主要由單核巨噬細胞、內皮細胞、T細胞、B細胞及纖維母細胞組成,是具有旁分泌和自分泌的細胞因子,可促進 T細胞和B細胞增殖、分化和分泌免疫球蛋白,參與免疫和炎癥過程。Hiromatsu等[8]用 RT-PCR檢測了Graves眼病患者的眼外肌與眼眶脂肪組織,發(fā)現(xiàn)眼外肌中IL-6表達較高,并且Graves眼病患者眼眶容量與IL-6 mRNA表達呈正相關。為模擬體外Graves眼病病理生理微環(huán)境,在本實驗細胞培養(yǎng)過程中添加生理濃度的IL-6細胞因子,使得T淋巴細胞及活化成纖維細胞的生物學特性盡量與體內環(huán)境一致。

圖4 [Tyr3]-octreotide的細胞攝取

4 結 論

1)將octreotide中的苯丙氨酸用酪氨酸替換,合成的[Tyr3]-octreotide能夠用于131I標記。

2)采用氯胺T法進行[Tyr3]-octreotide131I標記。標記中,氯胺T和[Tyr3]-octreotide用量分別為 1.6μg和 1.4μg,標記率可達85%。產(chǎn)品需要進一步純化。

3)Graves眼病主要炎癥反應細胞T淋巴細胞和活化的成纖維細胞對131I-[Tyr3]-octreotide均有明顯攝取,且明顯高于血管內皮細胞和脂肪細胞。結合[Tyr3]-octreotide與生長抑素受體的靶向結合作用和放射性核素的可探測性考慮,131I-[Tyr3]-octreotide具有用于Graves眼病發(fā)病過程中炎癥反應程度評估的應用潛力。

要結合[Tyr3]-octreotide的化學毒性作用和射線的非特異性殺傷作用,達到抑制Graves眼病炎癥反應進程的最終目的,還受限于131I-[Tyr3]-octreotide較低的細胞攝取率,需要進行進一步深入研究。

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