王 蕾 吳和平 舒筱燦 舒 旭 伍世揮 羅 海

心血管病事件快速發(fā)展是糖尿病患者死亡的常見原因。糖尿病引起心血管病發(fā)生的危險性增高的原因很多，其中高血糖誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激對內(nèi)皮細(xì)胞損傷在此過程中起重要作用。氧化應(yīng)激是指體內(nèi)活性氧(ROS)生成速率大于清除速率而在體內(nèi)蓄積的狀態(tài)。機體產(chǎn)生ROS有多種途徑;其中NADPH氧化酶(NOX)被認(rèn)為是血管內(nèi)皮細(xì)胞ROS產(chǎn)生的主要來源之一[1，2]。NADPH氧化酶是由多個亞基構(gòu)成的酶復(fù)合體，包括胞膜組分gp91phox和p22phox和胞質(zhì)組分p47phox、p67phox及 Rac;其中 p22phox是該氧化酶的酶促核心[3，4]。本實驗用高濃度葡萄糖處理人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVECs)，探討p47phox對ROS產(chǎn)生的調(diào)節(jié)機制。

材料與方法

1.主要試劑與儀器:M199培養(yǎng)基、Ⅱ型膠原酶、DPI、apocynin、胎牛血清、DCFH-DA熒光探針、p47phox抗體、流式細(xì)胞儀、熒光顯微鏡。

2.HUVECs的分離培養(yǎng):①取無菌新鮮臍帶，用0.9%鹽水沖洗臍靜脈;②0.1%的Ⅱ型膠原酶灌注臍靜脈15min;③離心灌注液收集內(nèi)皮細(xì)胞，將其轉(zhuǎn)移到培養(yǎng)瓶中，加入培養(yǎng)基放置培養(yǎng)箱中培養(yǎng);④待第二、三代細(xì)胞長至80%融合狀態(tài)時用于實驗。

3.流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞內(nèi)ROS水平:①用無血清的培養(yǎng)基沖洗細(xì)胞2次;②用1∶500稀釋DCFH-DA熒光探針在培養(yǎng)箱中孵育30min，PBS洗滌3次;③胰酶消化，血清終止反應(yīng)，無血清培養(yǎng)基洗滌2次;④重懸細(xì)胞，尼龍網(wǎng)過濾，⑤上流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞內(nèi)ROS。

4.western blotting檢測NOX4蛋白的表達(dá):①去培養(yǎng)基，用4℃的PBS洗滌細(xì)胞2次;②加0℃裂解液200μl，冰上孵育20min，③收集細(xì)胞裂片及裂解緩沖液，4℃12000g離心10min收集上清，測定蛋白濃度;④取200μg總蛋白與上樣緩沖液混勻總體積約30μl，沸水中加熱5min;⑤上樣電泳，待溴酚藍(lán)到達(dá)凝膠底部時，停止電泳;⑥蛋白質(zhì)電轉(zhuǎn)移1h;⑦蛋白質(zhì)雜交;⑧ECL化學(xué)發(fā)光法壓片顯影，定影。

5.免疫熒光檢測p47phox在細(xì)胞內(nèi)的定位:①用PBS洗滌細(xì)胞1次，95%乙醇固定15min，PBS洗3次每次5min;②3%牛血清清蛋白封閉15min;③稀釋適量比例的一抗孵育1h(陰性對照用PBS代替一抗)，PBS洗3次每次5min;④1∶50稀釋的FITC標(biāo)記的羊抗兔IgG孵育30min，PBS洗3次每次5min;⑤Hoechst33342常溫下孵育5min染核，PBS洗2次每次3min;⑥甘油封片，熒光顯微鏡下觀察。

6.實驗分組:①正對照組:給予正常培養(yǎng)基培養(yǎng);②高糖處理組:給予20mmol/L高濃度葡萄糖處理24h;③DPI處理組:5μmol/L DPI預(yù)處理0.5h后，給予20mmol/L葡萄糖處理24h;④apocynin處理組:100μmol/L apocynin預(yù)處理0.5h后再給予20mM葡萄糖處理24h。

7.統(tǒng)計學(xué)處理:所有數(shù)據(jù)采用平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，采用單因素方差分析檢驗，以P＜0.05判定差異的顯著性。

結(jié) 果

1.細(xì)胞內(nèi)ROS檢測:結(jié)果如圖1所示，正常對照組細(xì)胞內(nèi)ROS水平為1±0.05，高糖處理組為對照組的1.41(1.41±0.07)倍，二者相比差異具有顯著性(P＜0.05，n=3)。說明高濃度葡萄糖能夠刺激HUVECs內(nèi)活性氧升高。DPI處理組和apocynin處理組細(xì)胞內(nèi)ROS水平分別為0.49±0.07和1.01±0.05，與高糖組相比，差異均具有顯著性(P＜0.05，n=3)。說明DPI和apocynin能夠抑制高濃度葡萄糖刺激的活性氧升高。

圖1 流式細(xì)胞術(shù)檢測HUVECs內(nèi)ROS的產(chǎn)生

2.p47phox蛋白表達(dá):對照組細(xì)胞內(nèi)p47phox蛋白與內(nèi)對照β-actin的相對比值為0.82±0.05，高糖處理組為0.85±0.08，DPI處理組為0.81±0.02，apocynin處理組為0.88±0.01。各組之間差異均沒有顯著性(n=3，P＞0.05)，說明HUVECs內(nèi)p47phox的蛋白表達(dá)不受高濃度葡萄糖、DPI和apocynin的影響(圖2)。

圖2 western blot檢測HUVECs內(nèi)p47phox蛋白表達(dá)

3.p47phox在細(xì)胞內(nèi)定位:結(jié)果顯示(圖3)，各組免疫熒光強度無明顯差異;對照組、DPI處理組和apocynin處理組，p47phox主要在胞質(zhì)均勻分布，高糖處理組在胞膜周圍有高表達(dá)現(xiàn)象。說明高濃度葡萄糖能夠刺激p47phox向胞膜移位，而DPI和apocynin能夠抑制p47phox向胞膜移位。

圖3 間接免疫熒光檢測p47phox在HUVECs內(nèi)定位

討 論

糖尿病是最早被公認(rèn)的動脈粥樣硬化的重要危險因素之一，糖尿病并發(fā)心血管疾病是糖尿病患者死亡的主要原因。糖尿病引起心血管病發(fā)生的危險性增高的原因有很多，包括高血壓、異常脂血癥、腎病、胰島素抵抗、高血糖等;其中高血糖導(dǎo)致內(nèi)皮細(xì)胞氧化損傷在糖尿病并發(fā)動脈粥樣硬化過程中起重要作用。NADPH氧化酶被認(rèn)為是血管內(nèi)皮細(xì)胞ROS產(chǎn)生的主要來源之一。

大量研究表明，NOX的抑制劑DPI則能夠抑制高濃度葡萄糖刺激狀態(tài)下 HUVECs內(nèi)ROS的升高[3，5]。Silver在肥胖患者手術(shù)中取到的內(nèi)皮細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)p47phox的表達(dá)上調(diào)[6];Xia L等人發(fā)現(xiàn)，在高糖刺激下，腎小球系膜細(xì)胞內(nèi)的p47phox急劇升高并伴有大量ROS的產(chǎn)生[7]。為了探討高濃度葡萄糖刺激內(nèi)皮細(xì)胞內(nèi)ROS產(chǎn)生的機制，我們用高濃度葡萄糖處理HUVECs，并給予DPI和apocynin預(yù)處理。細(xì)胞內(nèi)ROS結(jié)果顯示，正常對照組持續(xù)產(chǎn)生低水平的活性氧，因為ROS是細(xì)胞內(nèi)重要的第二信使，調(diào)節(jié)細(xì)胞的生長及分化。高濃度葡萄糖能夠刺激HUVECs內(nèi)ROS的產(chǎn)生，而DPI及apocynin處理組ROS的產(chǎn)生并不增加，提示NOX是高糖所致ROS產(chǎn)生的主要來源之一。其中，有趣的是DPI干擾組ROS水平低于正常，可能有以下幾個原因:①DPI抑制NADPH氧化酶的能力強于apocynin;②DPI可能同時影響NADPH氧化酶體其他亞單位的變化。p47phox蛋白表達(dá)結(jié)果顯示，各組p47phox的表達(dá)水平都無明顯變化，說明p47phox對于ROS的調(diào)節(jié)作用可能不是通過表達(dá)的變化來實現(xiàn)的。

Li等[8]用血管緊張素Ⅱ刺激人血管內(nèi)皮細(xì)胞時觀察到細(xì)胞內(nèi)ROS水平顯著升高;分別提取細(xì)胞中不同亞成分，檢測到胞膜中的磷酸化p47phox增高;免疫細(xì)胞化學(xué)染色及共聚焦顯微鏡也觀察到p47phox在血管緊張素Ⅱ刺激后從胞質(zhì)向胞膜移位現(xiàn)象。我們推測在HUVECs中，高濃度葡萄糖刺激可能通過調(diào)節(jié)p47phox移位從而促進(jìn)NOX源性ROS的產(chǎn)生，因此我們用免疫熒光檢測p47phox的細(xì)胞內(nèi)定位。結(jié)果發(fā)現(xiàn)正常對照組的細(xì)胞中，p47phox主要在胞質(zhì)表達(dá)，DPI及apocynin預(yù)處理組則與正常對照組相似，而葡萄糖處理組在胞膜周圍有高亮度熒光表達(dá)，提示p47phox移向胞膜周圍。同時4組免疫熒光強度沒有明顯差異，再一次證明各組p47phox的蛋白表達(dá)水平無明顯改變。

我們的實驗結(jié)果證明，高濃度葡萄糖能夠刺激HUVECs內(nèi)NOX源性的ROS升高及p47phox向胞膜移位，DPI及 apocynin能夠抑制 ROS的升高和p47phox向胞膜移位，而各組p47phox的蛋白表達(dá)無明顯變化。提示47phox可能通過從胞質(zhì)向胞膜移位來調(diào)節(jié)高濃度葡萄糖刺激狀態(tài)下內(nèi)皮細(xì)胞ROS產(chǎn)生。

1 Ago T，Kitazono T，Ooboshi H，et al.NOX4 as the major catalytic component of an endothelial NAD(P)H oxidase.Circulation，2004，109(2):227-233

2 Sorescu D，Weiss D，Lassegue B，et al.Superoxide production and expression of NOX family proteins in human atherosclerosis.Circulation，2002，105(12):1429-1935

3 林宜，朱斌.NAD(P)H氧化酶與腎臟病關(guān)系及其研究進(jìn)展.醫(yī)學(xué)研究雜志，2007，36(1):99-100

4 Groemping Y，Lapouge K，Smerdon SJ，et al.Molecular basis of phosphorylation-induced activation of the NADPH oxidase.Cell，2003，113:343-355

5 丁莉，屈順林，王蕾，等.高葡萄糖刺激血管內(nèi)皮細(xì)胸尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶4表達(dá)上調(diào)，活性氧增加及細(xì)胞凋亡.中國動脈硬化雜志，2007，15(6):405-409

6 Silver AE，Beske SD，Christou DD，et al.Overweight and obese humans demonstrate increased vascular endothelial NAD(P)H oxidasep47(phox)expression and evidence of endothelial oxidative stress.Circulation.，2007，115(5):627-663

7 Xia L，Wang H，Goldberg HJ，et al.Mesangial cell NADPH oxidase upregulation in high glucose is protein kinase C dependent and required for collagen IV expression.Am J Physiol Renal Physiol，2006，290(2):F345-356

8 Li JM，Shah AM.Mechanism of Endothelial Cell NADPH Oxidase Activation by Angiotensin II.The Journal of Biological Chemistry，2003，278(14):2094-2100