鄒阮敏 胡芝 陳昊 張麗芳 張文淼 薛向陽(yáng) 黃引平

microRNA(miRNA)是一類短的(～22nt)、內(nèi)源性的、在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控基因表達(dá)的非編碼RNA[1]。許多腫瘤已發(fā)現(xiàn)miRNA失調(diào)表達(dá)，在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中起著關(guān)鍵的調(diào)控作用[2]。宮頸癌是女性發(fā)病率占第2位的惡性腫瘤。miRNA與宮頸癌的相關(guān)研究迄今僅約20篇文獻(xiàn)報(bào)道。最近發(fā)現(xiàn)miR-199a在腫瘤組織存在明顯差異表達(dá)，提示參與腫瘤發(fā)生發(fā)展。但miR-199a在不同癌組織存在上調(diào)/下調(diào)不一致表達(dá)現(xiàn)象[3～6]。在宮頸癌研究中不同學(xué)者研究結(jié)果也不一致[7，8]。另外，miR-199a與宮頸癌諸多臨床病理特征的關(guān)系少有研究。為此，本研究通過(guò)莖環(huán)Realtime RT-PCR檢測(cè)48例宮頸癌組織、12例宮頸上皮內(nèi)瘤樣病變(CIN)及20例正常宮頸組織miR-199a-3p和miR-199a-5p的表達(dá)，并分析其表達(dá)與宮頸癌臨床病理特征的關(guān)系，探討在宮頸鱗癌發(fā)生、發(fā)展中可能的調(diào)控作用及臨床意義。

材料與方法

1.實(shí)驗(yàn)材料:Trizol試劑購(gòu)自美國(guó) Invitrogen公司;MMLV反轉(zhuǎn)錄酶、RNA酶抑制劑、dNTPs、SYBR Mastermix等購(gòu)自Toyobo;引物由上海英駿生物技術(shù)有限公司合成。

2.標(biāo)本采集:48例宮頸鱗癌組織取自溫州市第二人民醫(yī)院2009年1～9月間的手術(shù)患者，均未行放、化療?；颊吣挲g31～72歲，中位年齡49.6歲。腫瘤直徑＜4cm 19例，≥4cm 29例。腫瘤類型:外生型19例，內(nèi)生型15例，潰瘍型10例，頸管型4例。病理分級(jí):G110例，G214例，G324例。臨床分期:按國(guó)際婦產(chǎn)科聯(lián)盟(FIGO)的分期標(biāo)準(zhǔn)，Ⅰ期8例，Ⅱ期26例，Ⅲ～Ⅳ期14例。12例CIN患者年齡28～61歲，中位年齡47.3歲。其中CINⅠ級(jí)2例、CINⅡ級(jí)5例、CINⅢ級(jí)5例。另取同期年齡匹配的子宮肌瘤手術(shù)的正常宮頸組織20份做對(duì)照。標(biāo)本離體后30min內(nèi)置于液氮保存。宮頸癌、CIN診斷及常規(guī)病理資料由兩位病理科醫(yī)師盲法閱片后提供。

3.總RNA的提取:取液氮保存的組織標(biāo)本，在液氮中碾碎至粉狀，按Trizol試劑說(shuō)明書提取總RNA，DEPC處理水溶解RNA。為增加小RNA得率，將異丙醇沉淀步驟改為-20℃沉淀2h以上。檢測(cè)RNA溶液OD260及OD280吸光值，計(jì)算RNA濃度和純度，OD260/OD280比值＞1.8方可用于檢測(cè)。1%瓊脂糖變性凝膠電泳檢測(cè)RNA的完整性。

4.莖環(huán)RT-qPCR檢測(cè)mir-199a表達(dá):根據(jù)已報(bào)道的莖環(huán)RT-qPCR方法，以U6作為內(nèi)參，分析mir-199a-5p、mir-199a-3p表達(dá)[9，10]。表1為相關(guān)分析的引物序列。1μg總RNA分別以mir-199a-5p和mir-199a-3p莖環(huán)反轉(zhuǎn)錄引物進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。為準(zhǔn)備定量PCR內(nèi)參模板cDNA，用相同的總RNA標(biāo)本以U6 RT引物為反轉(zhuǎn)錄引物進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系為1 μg總RNA、50nmol/L miRNA莖環(huán)RT引物(或 U6 RT 引物)、2U RNase inhibitor、5U M-MLV 反轉(zhuǎn)錄酶、0.5μmol/L dNTP。反應(yīng)條件為:16℃ 30min，42℃ 30min，75℃15min，反應(yīng)結(jié)束后-20℃保存。以15μl反應(yīng)體系進(jìn)行Realtime定量PCR。miRNA檢測(cè)反應(yīng)體系包括:1μl RT產(chǎn)物，1×SYBR Green I Mastermix，0.5μmol/L miRNA特異前向引物、0.5μmol/L反向引物。Real-time定量PCR條件為:95℃ 10 min后，95℃ 15s，60℃ 1min，40循環(huán)。Real-time定量 PCR使用Applied Biosystems 7500儀器進(jìn)行。所有樣品做3復(fù)孔。PCR產(chǎn)物經(jīng)8%PAGE電泳分析。記錄每個(gè)反應(yīng)管中的熒光信號(hào)到達(dá)所設(shè)定的域值時(shí)所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)即Ct值，以U6作為內(nèi)參照，采用定量PCR中的相對(duì)定量法，以N=2-ΔCt表示目的miRNA的表達(dá)相對(duì)于內(nèi)參的變化倍數(shù)，其中△Ct=CtmiRNA-CtU6。為增加數(shù)據(jù)直觀性，所有數(shù)據(jù)均放大1000倍。

5.統(tǒng)計(jì)學(xué)處理:由于miR-199a-5p和mir-199a-3p的表達(dá)數(shù)據(jù)呈非正態(tài)分布，故以中位數(shù)和四分位數(shù)間距表示。采用SPSS 16.0統(tǒng)計(jì)軟件的非參數(shù)秩和檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)處理。兩組間差異分析采用Mann-Whitney U檢驗(yàn)，3組及以上差異表達(dá)分析采用Kruskal-Wallis H檢驗(yàn)，取P＜0.05為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

表1 miRNA莖環(huán)RT實(shí)時(shí)PCR檢測(cè)相關(guān)引物序列

結(jié) 果

1.宮頸鱗癌、CIN及正常宮頸組織miR-199a-5p及miR-199a-3p的表達(dá):如miR-199a-5p和miR-199a-3p及U6的realtime PCR產(chǎn)物溶解曲線均為單峰，8%PAGE電泳顯示PCR產(chǎn)物為單一條帶，說(shuō)明莖環(huán)RT-PCR擴(kuò)增相應(yīng)的目的基因(圖1)。以U6為內(nèi)參，宮頸鱗癌組織中miR-199a-5p和miR-199a-3p的相對(duì)表達(dá)量(N=2-ΔCt)分別為0.68(0.43，1.97)和 2.91(1.90，6.55)，CIN 組織分別為0.87(0.56，1.94)和 3.87(1.99，7.26)，正常宮頸組織分別為2.80(1.75，4.43)和 12.92(6.23，17.95)(圖2)。采用非參數(shù)秩和檢驗(yàn)，宮頸鱗癌及CIN與正常宮頸組織的miR-199a-5p和miR-199a-3p表達(dá)差異有顯著性(P均＜0.05)，宮頸鱗癌與CIN組織的miR-199a-5p和miR-199a-3p表達(dá)差異無(wú)顯著性(P值分別為0.566和0.679)，提示同一前體起源的miR-199a-5p與miR-199a-3p在從正常宮頸向CIN及宮頸癌轉(zhuǎn)變過(guò)程中表達(dá)下調(diào)。進(jìn)一步分析miR-199a-5p與miR-199a-3p表達(dá)比值發(fā)現(xiàn)，miR-199a-5p/miR-199a-3p表達(dá)比值在宮頸鱗癌、CIN及正常宮頸組織分別為0.25(0.22，0.28)、0.26(0.22，0.30)及 0.24(0.21，0.27)，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.219)。

圖1 miR-199a-3p、miR-199a-5p及U6內(nèi)參 Real-time PCR溶解曲線和8%PAGE電泳圖

圖2 宮頸鱗癌、CIN及正常宮頸組織中miR-199a-3p及miR-199a-5p表達(dá)水平

2.不同臨床病理特征的宮頸鱗癌組織中miR-199a-5p與miR-199a-3p表達(dá):不同病理分級(jí)的宮頸鱗癌組織中miR-199a-5p的表達(dá)存在一定差異(P=0.054)，宮頸鱗癌G3組織中miR-199a-5p的表達(dá)量低于G1、G2組織;而miR-199a-3p在不同病理分級(jí)的宮頸鱗癌組織中差異不顯著(P=0.107);不同年齡、腫瘤直徑、腫瘤類型及臨床分期的宮頸鱗癌組織中miR-199a-5p、miR-199a-3p表達(dá)量的比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)(表2)。

表2 宮頸癌中miR-199a-5p與miR-199a-3p表達(dá)和臨床病理因素的相關(guān)性分析

討 論

miRNA(microRNA)是近年來(lái)在多種真核細(xì)胞和病毒中發(fā)現(xiàn)的一類非編碼蛋白的短序列(21～23個(gè)核苷酸)RNA片段，其轉(zhuǎn)錄前體(Pri-miRNA)在核內(nèi)被RnaseⅢ核酸酶Drosha加工成約70個(gè)核苷酸長(zhǎng)的發(fā)夾狀的RNA，在Exportin5的幫助下從核內(nèi)進(jìn)入胞質(zhì)，然后在Dicer酶的作用下，單鏈的miRNA進(jìn)入一個(gè)核糖蛋白復(fù)合體miRNP。miRNA通過(guò)與靶基因的3'UTR區(qū)互補(bǔ)配對(duì)，指導(dǎo)miRNP復(fù)合體對(duì)靶基因mRNA進(jìn)行切割或者翻譯抑制，起著調(diào)控基因功能的作用，在腫瘤的發(fā)生過(guò)程中可作為腫瘤抑制或促進(jìn)因子發(fā)揮樞紐調(diào)控效應(yīng)[1，11，12]。

miR-199a是座落于DNM2基因16號(hào)內(nèi)含子的miRNA，前體結(jié)構(gòu)中的miR-199a-5p為通常稱謂的miR-199a，而 miR-199a-3p即為 miR-199a*。最近研究顯示，miR-199a-5p和miR-199a-3p在許多腫瘤組織存在明顯差異表達(dá)。但不同的腫瘤組織miR-199a-5p、miR-199a-3p存在上調(diào)/下調(diào)不一致表達(dá)現(xiàn)象。Ichimi T等[3]研究發(fā)現(xiàn)，miR-199a-3p在膀胱癌組織中表達(dá)明顯下調(diào)，發(fā)揮抑癌的效應(yīng)，其靶基因?yàn)?Keratin7(KRT7)。Murakami等[6]的結(jié)果顯示 miR-199-5p、miR-199a-3p 在肝細(xì)胞癌中的表達(dá)低于正常組織，且表達(dá)水平與肝細(xì)胞癌的分化程度呈負(fù)相關(guān)。Nam EJ等[4]的研究也發(fā)現(xiàn)嚴(yán)重卵巢癌組織中miR-199a表達(dá)下調(diào)與預(yù)后相關(guān)。但Song G等[5]的研究顯示胃癌組織miR-199a表達(dá)上調(diào)。不同腫瘤組織miR-199a-5p及miR-199a-3p表達(dá)不一致可能的原因之一是miR-199a和染色體重構(gòu)復(fù)合體SWI/SNF的亞單位Brm通過(guò)Egr1雙負(fù)反饋環(huán)導(dǎo)致不同類型腫瘤miR-199a表達(dá)的不一致性[13]。但是在宮頸癌組織，不同學(xué)者的研究結(jié)果也不一致。

Lee JW等[7]報(bào)道宮頸癌組織miR-199a-5p及miR-199a-3p表達(dá)上調(diào)，下調(diào)miR-199a表達(dá)抑制宮頸癌細(xì)胞增殖。然而，Pereira PM等[8]研究顯示，miR-199a在宮頸癌組織表達(dá)下調(diào)。分析其原因，除了miR-199a-Brm雙負(fù)反饋調(diào)節(jié)外，選擇不同內(nèi)參也是導(dǎo)致不同結(jié)果的原因。Lee JW等采用的是let-7a作為內(nèi)參，Pereira PM等采用是U6作為內(nèi)參。已有文獻(xiàn)報(bào)道let-7a在宮頸癌及非癌組織存在差異表達(dá)[14]。為此，本研究采用U6作為內(nèi)參進(jìn)行分析。結(jié)果表明miR-199a-3p和miR-199a-5p在宮頸癌及CIN組織均明顯下調(diào)表達(dá)。提示miR-199a-3p和miR-199a-5p作為抑癌基因發(fā)揮效應(yīng)。

由于絕大多數(shù)pre-miRNA進(jìn)入胞質(zhì)后被Dicer加工成短暫存在的長(zhǎng)度約22nt的類似于siRNA雙鏈miRNA。雙鏈miRNA解開后，自于pre-miRNA一條臂的成熟miRNA進(jìn)入RISC中，發(fā)揮效應(yīng)。premiRNA的另外一條臂產(chǎn)生一個(gè)長(zhǎng)度與miRNA相同的片段-miRNA*常被降解[1]。本研究結(jié)果顯示，不管是宮頸癌、CIN還是正常宮頸組織miR-199a-5p/miR-199a-3p表達(dá)比值均為0.25左右，說(shuō)明miR-199-5p和miR-199a-3p常同時(shí)存在于細(xì)胞內(nèi)，共同發(fā)揮調(diào)控效應(yīng)，而miR-199a-3p是更加穩(wěn)定的miRNA。其原因及在宮頸癌中的作用機(jī)制尚需后續(xù)進(jìn)一步研究。

分析miR-199-5p和miR-199a-3p表達(dá)水平與宮頸癌多種臨床病理特征的關(guān)系發(fā)現(xiàn)，miR-199-5p表達(dá)在不同病理分級(jí)的宮頸鱗癌組織存在一定差異(P=0.054)，與其他臨床病理因素未見(jiàn)顯著性差異。小細(xì)胞型(Ⅲ級(jí))宮頸癌的miR-199-5p的表達(dá)低于于其他細(xì)胞分化類型的標(biāo)本。上述結(jié)果表明，miR-199-5p在宮頸癌組織明顯下調(diào)表達(dá)不但是宮頸癌重要的標(biāo)志，而且可輔助指示腫瘤組織的分化程度。

1 Bartel DP.MicroRNAs:genomics，biogenesis，mechanism，and function.Cell，2004，116(2):281-297

2 Zimmerman AL，Wu S.MicroRNAs，cancer and cancer stem cells.Cancer Lett，2011，300(1):9-10

3 Ichimi T.Identification of novel microRNA targets based on microRNA signatures in bladder cancer.Int J Cancer，2009，125(2):345-352

4 Nam EJ.MicroRNA expression profiles in serous ovarian carcinoma.Clin Cancer Res，2008，14(9):2690-2695

5 Song G.miR-199a regulates the tumor suppressor mitogen-activated protein kinase kinase kinase 11 in gastric cancer.Biol Pharm Bull，2010，33(11):1822-1827

6 Murakami Y.Comprehensive analysis of microRNA expression patterns in hepatocellular carcinoma and non-tumorous tissues.Oncogene，2006，25(17):2537-2545

7 Lee JW.Altered MicroRNA expression in cervical carcinomas.Clin Cancer Res，2008，14(9):2535-2542

8 Pereira PM.MicroRNA expression variability in human cervical tissues.PLoS One，2010，5(7):e11780

9 Xue X.Identification and characterization of novel microRNAs from Schistosoma japonicum.PLoS One，2008，3(12):e4034

10 Chen C.Real-time quantification of microRNAs by stem-loop RT-PCR.Nucleic Acids Res，2005，33(20):e179

11 Plasterk RH，Micro RNAs in animal development.Cell，2006，124(5):877-881

12 Zamore PD，B Haley.Ribo-gnome:the big world of small RNAs.Science，2005，309(5740):1519-1524

13 Sakurai K.microRNAs miR-199a-5p and-3p target the Brm subunit of SWI/SNF to generate a double-negative feedback loop in a variety of human cancers.Cancer Res，2011，71(5):1680-1689

14 Zhang Y，Microarray profile of micro-ribonucleic acid in tumor tissue from cervical squamous cell carcinoma without human papillomavirus.J Obstet Gynaecol Res，2009，35(5):842-849