鄭 烈 葉丙霖

(甘肅省中醫(yī)院，甘肅省蘭州市七里河區(qū)安西路 518號(hào)，730050)

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物、分組與模型的制備 SPF級(jí) Wistar大鼠 50只，雌雄各半，體重 200±20g。購(gòu)于甘肅中醫(yī)學(xué)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心(實(shí)驗(yàn)動(dòng)物質(zhì)量合格證編號(hào):SCXK(H)2004-0006-0000005)，動(dòng)物飼料由上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限責(zé)任公司提供。參照文獻(xiàn)[1]，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物隨機(jī)分為 5組，每組 10只，雌雄各半，分為空白組、模型組、關(guān)節(jié)炎丸大劑量組、關(guān)節(jié)炎丸小劑量組、雷公藤陽(yáng)性對(duì)照組。模型的制備用 75%乙醇對(duì)大鼠右足跖進(jìn)行消毒，將弗氏完全佐劑 0.1mL/只，注射于大鼠足跖皮下?？瞻捉M大鼠注射生理鹽水 0.lmL/只。

1.2 實(shí)驗(yàn)藥品與試劑 關(guān)節(jié)炎丸由制附片、制川烏、細(xì)辛、白芍、桂枝、黃芪、甘草等藥物組成，具有補(bǔ)益氣血、溫腎養(yǎng)肝、健脾除濕的功效。為棕褐色顆粒，由甘肅中醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院制劑室提供。雷公藤多甙片(湖南協(xié)力藥業(yè)有限公司，生產(chǎn)批號(hào):Z43020138)，弗氏完全佐劑由美國(guó) Sigma公司生產(chǎn)。

1.3 給藥方法 參照文獻(xiàn)[2]，根據(jù)人和動(dòng)物間體表面積的換算關(guān)系，取關(guān)節(jié)炎丸濃煎液，按生藥量計(jì)算為7.2g/mL，每天關(guān)節(jié)炎丸大劑量組給予 3mL/只、關(guān)節(jié)炎丸小劑量組給予 1.5mL/只、空白組和模型組均給予生理鹽水 1mL/只，雷公藤多甙片組給予雷公藤多甙片6.3mg/kg每天。給藥至實(shí)驗(yàn)結(jié)束。

1.4 測(cè)定方法 關(guān)節(jié)腫脹度采用玻璃容器排水法測(cè)量:首先在每只大鼠的踝關(guān)節(jié)下做一標(biāo)記。其次向內(nèi)徑 2cm的 20mL量筒內(nèi)注入純凈水，液面與量筒最高刻度平齊。用最小刻度為 0.1mL的 5mL注射用針管吸取量筒內(nèi)純凈水約 3mL。再把大鼠足跖緩緩伸入量筒內(nèi)，使標(biāo)記與量筒最高刻度平齊。再用已吸入 3mL水的針管向量筒內(nèi)慢慢注入水液，使液面再次與最高刻度及標(biāo)記平齊。從注射器上的刻度處讀出其內(nèi)部剩余液體體積，即為大鼠的足趾體積。重復(fù) 2次取均值。實(shí)驗(yàn)開(kāi)始后每日用上述方法對(duì)各組大鼠足跖體積測(cè)量一次，并做記錄。關(guān)節(jié)病理檢查采用常規(guī)石蠟包埋、切片、HE染色后光學(xué)顯微鏡觀(guān)察。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以 ˉx±s表示，采用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)程序進(jìn)行單因素方差分析，組間比較選用 LSD及 SNK分析。

表1 各組大鼠右后足跖腫脹度的比較(ˉx±s)

表 2(續(xù)表 1) 各組大鼠右后足跖腫脹度的比較(ˉx±s)

表 3(續(xù)表 1) 各組大鼠右后足跖腫脹度的比較(ˉx±s)

圖1 各組實(shí)驗(yàn)大鼠右足跖體積變化曲線(xiàn)

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠關(guān)節(jié)腫脹度的比較 結(jié)果見(jiàn)表 1、表 2、表 3及圖 1。

2.2 關(guān)節(jié)病理 取右后足跖關(guān)節(jié)經(jīng) EDTA脫鈣后，選取相同部位的關(guān)節(jié)組織，用 10%甲醛固定，石蠟包埋切片，HE染色，在光學(xué)顯微鏡下觀(guān)察，病理結(jié)果與大多文獻(xiàn)報(bào)道相符合[3]?？瞻捉M:軟骨表面光滑，基質(zhì)呈均質(zhì)狀，軟骨細(xì)胞排列層次清楚。模型組:可見(jiàn)大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，軟骨有不同程度缺損，部分深達(dá)軟骨下骨，缺損區(qū)內(nèi)有肉芽組織，滑膜血管增多，軟骨細(xì)胞排列不規(guī)則，基質(zhì)分布不均。大劑量組:可見(jiàn)滑膜血管顯著減少，軟骨表面基本光滑，基質(zhì)較為均勻，軟骨細(xì)胞排列層次清楚，未見(jiàn)明顯的軟骨及軟骨下骨質(zhì)破壞。小劑量組:可見(jiàn)滑膜細(xì)胞有不同程度的增生，軟骨表面不光滑，基質(zhì)分布基本均勻，軟骨細(xì)胞排列層次較清楚。雷公藤組:可見(jiàn)軟骨表面不光滑，基質(zhì)分布基本均勻，部分軟骨細(xì)胞出現(xiàn)堆積、壞死，滑膜內(nèi)炎性細(xì)胞浸潤(rùn)及血管炎表現(xiàn)均顯著減輕。

3 討論

本實(shí)驗(yàn)借助佐劑型關(guān)節(jié)炎大鼠模型來(lái)探討關(guān)節(jié)炎丸對(duì)關(guān)節(jié)腫脹度和病理改變的影響。由表 1及圖 1可以看出:造模后第 1日，造模各組大鼠右足跖開(kāi)始出現(xiàn)腫脹，其體積與空白組對(duì)照有極顯著性差異(P＜0.01)。模型組大鼠在造模后右足跖體積迅速腫脹，隨后又逐漸減輕，6d后再度腫脹，此則為繼發(fā)性炎癥反應(yīng)，20d左右達(dá)到高峰。此時(shí)其他癥狀則表現(xiàn)為對(duì)側(cè)和前足腫脹，且進(jìn)行性加重，行動(dòng)不便，耳和尾部出現(xiàn)關(guān)節(jié)炎小結(jié)，體重較空白組增長(zhǎng)明顯緩慢，這些表現(xiàn)接近人 RA。給藥各組在給藥一周后足跖體積開(kāi)始逐漸、持續(xù)下降，其足跖體積在第 23d時(shí)與模型組比較已有明顯差異(P＜0.05)，說(shuō)明各組治療藥物均有效。而且關(guān)節(jié)炎丸大劑量組治療效果比小劑量組和雷公藤組明顯;在 25d后其體積與空白組比較已無(wú)顯著差異(P＞0.05)，說(shuō)明其炎癥已基本接近正常;在第 29d時(shí)與其他 2個(gè)治療組比較已有明顯差異(P＜0.05)，說(shuō)明關(guān)節(jié)炎丸大劑量組治療效果明顯優(yōu)于小劑量組與雷公藤組，表明關(guān)節(jié)炎丸能顯著抑制大鼠的足跖腫脹度。俞小芬等[4]研究表明，關(guān)節(jié)炎丸可通過(guò)抑制細(xì)胞因子TNF-a、IL-1的增加，從而改善關(guān)節(jié)炎癥的紅腫疼痛。病理形態(tài)學(xué)也顯示關(guān)節(jié)炎丸較雷公藤對(duì)照組能明顯抑制佐劑型關(guān)節(jié)炎大鼠關(guān)節(jié)滑膜的炎癥，抑制滑膜破壞及血管翳生成，防止骨關(guān)節(jié)畸形發(fā)生。這些實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)一步佐證了關(guān)節(jié)炎丸對(duì)類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的治療作用，為進(jìn)行臨床試驗(yàn)研究提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。今后應(yīng)當(dāng)從關(guān)節(jié)的微觀(guān)入手，深入探討關(guān)節(jié)炎丸治療類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的內(nèi)在機(jī)制。

[1]徐淑云.藥理實(shí)驗(yàn)方法學(xué)[M].第二版.北京:人民衛(wèi)生出版社，1991:723-724.

[2]章元沛.藥理學(xué)實(shí)驗(yàn)[M].第二版.北京:人民衛(wèi)生出版社，1982:238.

[3]章敏，趙映前.熱痹顆粒劑治療類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的作用機(jī)理研究.中成藥，2006，28(12):1787.

[4]俞小芬，薛盟舉，鄭烈.關(guān)節(jié)炎丸對(duì)大鼠佐劑性關(guān)節(jié)炎治療作用的實(shí)驗(yàn)研究.世界中醫(yī)藥，2008，3(2):113.