陳磊磊 陳隨清 王 靜

(河南中醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院辦公室，河南省鄭州市金水區(qū)金水路1號，450008)

山茱萸是山茱萸科植物山茱萸(Cornus officinalis Sieb.et Zucc.)除去果核的干燥成熟果肉［1］，主產(chǎn)于我國的河南、浙江、陜西等省，具有補(bǔ)益肝腎、澀精固脫的功效，為常用中藥材。現(xiàn)代研究證明:山茱萸中含有多種成分，如環(huán)烯醚萜苷類、有機(jī)酸類、鞣質(zhì)類、多糖、氨基酸、維生素及礦質(zhì)元素等。其中有機(jī)酸種類多、含量豐富，如熊果酸、齊墩果酸等［2］。目前發(fā)現(xiàn)多種有機(jī)酸均有生理活性，如齊墩果酸具有清熱、保肝、消炎、抑菌、強(qiáng)心、利尿等作用［3］。研究不同采收期山茱萸總有機(jī)酸含量變化，可以為山茱萸最佳采收期提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與儀器

1.1 材料及試劑 山茱萸藥材分別采自河南西峽、浙江臨安、陜西佛坪，經(jīng)鑒定為山茱萸科植物山茱萸果實(shí)(Cornus officinalis Sieb.et Zucc.);酒石酸(天津石英鐘廠霸州市化工分廠，純度99.5%);氫氧化鈉，鄰苯二甲酸氫鉀，酚酞，乙醇均為分析純;雙蒸水(自制)。

1.2 儀器 數(shù)控超聲波清洗器(KQ-500DV，昆明市超聲儀器有限公司);pH計(jì)(PHS-2C，上海大譜儀器有限公司);磁力攪拌器(78-HW，金壇市文華科教實(shí)驗(yàn)儀器廠);恒溫水浴鍋(HH-S，鞏義市英峪予華儀器廠);電子天平(BS224S，北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司);熱風(fēng)循環(huán)烘箱(CT-C，常州市干燥設(shè)備廠有限公司)。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 對照品溶液的配制 精密稱取105℃干燥至恒重的酒石酸1.5g，置100mL容量瓶中，加80%乙醇溶解并定容至刻度，配制成15.005mg/mL的酒石酸溶液，備用。

2.2 NaOH溶液的配制 取氫氧化鈉飽和溶液上清液5.6mL，加新沸過的冷水定容至1000mL，密封保存，標(biāo)定后使用。

2.3 樣品溶液的制備 精密稱取山茱萸粉末5.0g，置于具塞錐形瓶中，加入10倍量80%乙醇溶液，稱重，超聲30min，補(bǔ)齊重量，過濾。濾渣重復(fù)提取1次，合并濾液，備用。

2.4 樣品溶液提取方法學(xué)考察 為系統(tǒng)考察各種因素對提取結(jié)果的影響，采用正交實(shí)驗(yàn)，考察提取方法、乙醇濃度、提取時(shí)間、提取次數(shù)4個(gè)因素，測定總有機(jī)酸含量，選用L9(34)正交表設(shè)計(jì)，因素、水平見下表1，實(shí)驗(yàn)結(jié)果和方差見表2、表3。

表1 因素水平表

表2 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果

表3 提取方法考察 方差分析表

由表2可以看出影響山茱萸總有機(jī)酸提取的主次因素為:B＞D＞C＞A，從均值可看出最佳提取方案為:A2B2C2D3。從表3可看出P＞0.05，各因素對提取結(jié)果影響無顯著性差異。最終選擇超聲提取，80%乙醇，提取時(shí)間1h，提取2次作為最佳提取條件，采用此方法對山茱萸樣品總有機(jī)酸進(jìn)行3次提取試驗(yàn)，提取的總有機(jī)酸含量平均為10.51%。

2.5 測定方法 參照《中國藥典》2010年版附錄ⅧA電位滴定法與永停滴定法［4］，精密移取20mL待測溶液置于250mL錐形瓶中，置電磁攪拌器上，將連接有pH計(jì)的pH復(fù)合電極插入液面下，放入攪拌子，開啟攪拌，記錄電位值，用0.1mol/L NaOH滴定液滴定，開始時(shí)可每次加入較多的量，攪拌，記錄電位;至將近終點(diǎn)前，則應(yīng)每次加入少量，攪拌，記錄電位;至突躍點(diǎn)已過，仍應(yīng)繼續(xù)滴加幾次滴定液，并記錄電位。照電位滴定法確定滴定終點(diǎn)的方法計(jì)算滴定終點(diǎn)。

2.6 酒石酸對照品突躍范圍模擬試驗(yàn) 準(zhǔn)確吸取酒石酸對照品溶液 20mL，按 2.4項(xiàng)測定方法，用0.1178mol/L NaOH滴定液測定。酒石酸對照品一階導(dǎo)數(shù)滴定曲線和二階導(dǎo)數(shù)滴定曲線分別為圖1-A，圖1-B。由圖1-A可見曲線對應(yīng)的最大值為44.95mL，圖 1-B可計(jì)算出曲線過原點(diǎn)的值為44.91mL，曲線顯示滴定終點(diǎn)明顯。二階導(dǎo)數(shù)計(jì)算過程能減少滴定誤差造成的影響，使結(jié)果更準(zhǔn)確，因此本實(shí)驗(yàn)結(jié)果采用二階導(dǎo)數(shù)進(jìn)行計(jì)算。

2.7 電位滴定方法學(xué)考察

2.7.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立 從酒石酸對照品溶液中分別吸取 5mL、8mL、20mL、40mL，用 80% 乙醇稀釋至50mL，以上5個(gè)濃度分別用2.4項(xiàng)下電位滴定法測定，以消耗的NaOH的量為縱坐標(biāo)，以所含酒石酸的量為橫坐標(biāo)，建立標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程Y=17.584x-0.1176，R2=0.9999，表明酒石酸在 0.0300mg ～0.3001mg線性關(guān)系良好。

2.7.2 穩(wěn)定性考察 稱取樣品粉末10.0020g，按2.3項(xiàng)方法提取得樣品液，分別在 0、2、4、8、12、20h，按 2.4項(xiàng)進(jìn)行測定，計(jì)算RSD值為0.39%，表明樣品液在20h內(nèi)穩(wěn)定。

2.7.3 精密度考察 稱取樣品粉末10.0014g，按2.3項(xiàng)方法提取得樣品液，按2.4項(xiàng)下測定6次，計(jì)算RSD值為0.48%，表明本法精密度良好。

2.7.4 重現(xiàn)性考察 取同一山茱萸樣品粉末6份，按2.3項(xiàng)方法提取得樣品液，按照2.4項(xiàng)下進(jìn)行測定，計(jì)算RSD值為1.55%，表明本法重現(xiàn)性良好。

2.7.5 加樣回收率 精密稱取已知含量的樣品粉末5份，加入與樣品含量相近的酒石酸標(biāo)準(zhǔn)品，按2.3項(xiàng)方法制備樣品溶液，按照2.4項(xiàng)下進(jìn)行測定，計(jì)算加樣回收率平均值為101.44%，RSD值為1.56%。

3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

按2.3項(xiàng)方法制備樣品溶液，按照2.4項(xiàng)下進(jìn)行測定，計(jì)算樣品中酒石酸的含量。3個(gè)地方不同采收期山茱萸藥材的樣品總有機(jī)酸含量測定結(jié)果。見表4。

表4 3個(gè)地方山茱萸樣品總有機(jī)酸含量(%)

4 討論

4.1 對測定結(jié)果分析，3個(gè)產(chǎn)地的樣品總有機(jī)酸含量隨果實(shí)的逐漸成熟呈增長趨勢，說明總有機(jī)酸有一個(gè)逐漸積累的過程。同一時(shí)期3個(gè)產(chǎn)地樣品的總有機(jī)酸含量差異較大，但對總有機(jī)酸達(dá)到相近含量的時(shí)間進(jìn)行比較，顯示陜西比河南、浙江提前20天左右，這與3個(gè)地區(qū)山茱萸成熟期和傳統(tǒng)采收期的差異一致。通過本實(shí)驗(yàn)可看出山茱萸總有機(jī)酸含量與山茱萸果實(shí)成熟期有相關(guān)性，山茱萸總有機(jī)酸含量動(dòng)態(tài)變化規(guī)律可以為確定最佳采收期提供依據(jù)。

4.2 總有機(jī)酸測定多采用酸堿滴定法，由于中藥材提取液顏色較深，使指示劑的選擇受到限制，同時(shí)滴定終點(diǎn)不明顯，用活性炭脫色會對有機(jī)酸有一定吸附，影響測定結(jié)果。我們采用直接電位滴定法，避免酸堿滴定法中有機(jī)酸提取液顏色對滴定終點(diǎn)的干擾，結(jié)果表明電位滴定法測定山茱萸總有機(jī)酸，方法的重現(xiàn)性、精密度、穩(wěn)定性都比較好，可操作性強(qiáng)。

4.3 在提取過程中，比較了水、丙酮和50%乙醇3種不同溶媒的提取效率，結(jié)果水和50%乙醇對總有機(jī)酸提取率較高，50%乙醇提取液在滴定中突躍明顯，所以在提取方法考察中選取不同濃度的乙醇進(jìn)行考察。

［1］中華人民共和國衛(wèi)生部藥典委員會.中華人民共和國藥典(2010年版一部)［S］.北京:化學(xué)工業(yè)出版社，2010:26.

［2］李平，余象煜.山茱萸果實(shí)的化學(xué)成分.中國野生植物資源，1990，(3):13.

［3］楊劍芳，路福平，高文遠(yuǎn)，等.山茱萸的化學(xué)、藥理及開發(fā)應(yīng)用研究進(jìn)展.現(xiàn)代生物醫(yī)學(xué)進(jìn)展，2006(12):127-131.

［4］中華人民共和國衛(wèi)生部藥典委員會.中華人民共和國藥典(2010年版一部附錄)［S］.北京:化學(xué)工業(yè)出版社，2010:46.