樊任珠 汪 悅 徐建亞 桑 鋒

(南京中醫(yī)藥大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院，江蘇省南京市棲霞區(qū)仙林大道138號(hào)南京中醫(yī)藥大學(xué)E3-304室，210046)

類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(Rheumatoid Arthritis，RA)是一種常見的慢性炎癥性疾病，多種免疫細(xì)胞因子失調(diào)可導(dǎo)致微血管新生而形成血管翳［1］。痹痛靈顆粒為名老中醫(yī)汪履秋經(jīng)驗(yàn)方，多年來臨床應(yīng)用于治療類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎具有顯著的臨床療效［2］。本研究通過建立大鼠膠原誘導(dǎo)性關(guān)節(jié)炎模型，觀察痹痛靈對(duì)類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎大鼠肺組織微血管密度及IL-17表達(dá)的影響，探討其治療類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎抗血管新生的作用機(jī)理。

1 材料

1.1 動(dòng)物 Wister大鼠，清潔級(jí)，4～6周齡，平均體重為(180±15)g(上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物責(zé)任有限公司)。

1.2 主要儀器 TP 1020自動(dòng)脫水機(jī)(德國LEICA公司)，RM2135型石蠟切片機(jī)(德國LEICA公司)，Tissue-Tek TEL組織包埋中心(日本SAKURA公司產(chǎn)品)，Minisee病理圖像采集系統(tǒng)，實(shí)時(shí)熒光PCR定量分析儀(LightCycle Roche公司)。

1.3 主要試劑 Rabbit anti FⅧ即用型快速免疫組化試劑(福州邁新生物公司RAB-0070)，引物和探針(上海生工生物工程有限公司);痹痛靈顆粒浸膏(組成:麻黃、桂枝、制川烏、蜈蚣、桃仁等)，雞 II型膠原(上海本草生物醫(yī)學(xué)工程研究所)，雷公藤多苷片(10mg/片，恒生藥業(yè)有限公司)，博來霉素(日本化藥株式會(huì)社)。

2 方法

2.1 膠原性關(guān)節(jié)炎的誘發(fā)及肺纖維化模型 參考文獻(xiàn)［3-4］進(jìn)行。

2.2 分組及處理 60只大鼠隨機(jī)選取10只為正常組，另50只造模，共成模40只，隨機(jī)分為5組各8只。正常組與模型組均給予等容量蒸餾水;痹痛靈高、中、低劑量組分別給予痹痛靈顆粒14g生藥/kg、7g生藥/kg、3.5g生藥/kg體重;雷公藤組給予雷公藤多苷片9mg/kg體重。各組均于造模第21天開始給藥，1次/d，共給藥 15d。

2.3 組織標(biāo)本的采集與處理方法 給藥3周后將動(dòng)物處死，留取肺組織標(biāo)本。

2.4 肺組織病理學(xué)檢查 光學(xué)顯微鏡下觀察肺泡炎和肺纖維化，隨機(jī)選擇5個(gè)視野，根據(jù) Szapiel［5］等方法，肺泡炎和纖維化程度各分為4級(jí):無肺泡炎(0)，輕度肺泡炎(1)，中度肺泡炎(2)，重度肺泡炎(3)。

2.5 肺組織血管密度計(jì)數(shù)(MVD)免疫組化過程［6］采用快速免疫組化方法，寧闕圖形分析系統(tǒng)下定量觀察，血管內(nèi)皮細(xì)胞呈棕色。400倍視野下計(jì)數(shù)5個(gè)視野的數(shù)目。

2.6 RealTime-PCR引物設(shè)計(jì) 根據(jù)GenBank發(fā)布序列進(jìn)行引物設(shè)計(jì)，使上下游引物跨越2個(gè)內(nèi)含子，以排除DNA干擾，經(jīng)NCBIBLAST檢索無顯著同源性序列，內(nèi)對(duì)照為β-actin，IL-17 Sense primer:tgagagttgacattcgcatctt，Antisenseprimer: gatacagcctgagtgtctgcac，Product size160。

表1 各組大鼠肺泡炎程度比較

表2 各組大鼠肺組織MVD的相對(duì)數(shù)量

表3 各組大鼠肺組織IL-17 mRNA基因的相對(duì)含量(ˉx±s)

2.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法所有數(shù)值變量以ˉx±s表示，15.0統(tǒng)計(jì)軟件處理。RealTime-PCR實(shí)驗(yàn)采用比較2-△△Ct法分析。

3 結(jié)果

3.1 各組大鼠肺泡炎同程度比較 見表1。各給藥組肺泡炎都有不同程度減輕，與模型組比較，統(tǒng)計(jì)差異有顯著性。

3.2 各組大鼠肺組織MVD的相對(duì)數(shù)量 見表2。各給藥組動(dòng)物MVD均低于模型組，且以痹痛靈高、中劑量組和雷公藤多苷片組效果較為顯著，與模型組比較，差異有顯著性。

3.3 各組大鼠肺組織膜組織IL-17 mRNA的相對(duì)含量 見表3。痹痛靈高中劑量組和雷公藤多苷片組比模型組IL-17在肺組織中表達(dá)≥2倍，基因表達(dá)降低。

4 討論

RA主要病理變化為滑膜血管新生、細(xì)胞增殖，多種細(xì)胞因子參與了這一過程。病變的血管新生主要取決于促血管生長因子和抑制血管生長因子間的平衡［7］。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示CIA大鼠肺組織病理過程中MVD和細(xì)胞因子IL-17 mRNA水平增高，RA的血管新生有多種細(xì)胞因子參與，IL-17是前細(xì)胞因子主要由活化的記憶性CD+4T淋巴細(xì)胞分泌，是一種血管生成調(diào)節(jié)因子，刺激血管內(nèi)皮細(xì)胞遷移和血管素形成，并上調(diào)多種血管形成因子表達(dá)，有促血管生成作用［8］。IL-17還與其他炎性細(xì)胞因子如腫瘤壞死因子TNF-α、IL-1β等產(chǎn)生協(xié)同作用，可誘導(dǎo)滑膜細(xì)胞分泌血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)，導(dǎo)致血管新生，關(guān)節(jié)破壞加重［9］。

痹痛靈主要用散寒祛濕，祛瘀通絡(luò)法治療RA，用于臨床療效確切。方中麻黃可散寒通滯、發(fā)汗解表，桂枝可溫通經(jīng)脈、發(fā)汗解肌。麻黃、桂枝配伍具有協(xié)同作用。川烏、蜈蚣藥理研究均有解熱、鎮(zhèn)痛作用。桃仁可活血祛瘀。本研究表明痹痛靈能明顯下調(diào)模型大鼠肺組織中MVD和IL-17 mRNA相對(duì)含量，從而可能發(fā)揮抗血管新生等作用治療類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎肺部病變。

［1］徐育冬，靳洪濤.類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎與促血管新生的細(xì)胞因子.中華風(fēng)濕病學(xué)雜志，2007，10(11):633-635.

［2］江星.痹痛靈治療類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎寒濕痹阻證臨床觀察.河南中醫(yī)，2008，28(10):33-35.

［3］湯文璐，李俊，徐淑云，等.II型膠原性關(guān)節(jié)炎動(dòng)物模型的研究概況.中國藥理學(xué)報(bào)，1998，14:495-498.

［4］胡靜，劉旭凌.經(jīng)鼻滴入博萊霉素致小鼠肺纖維化模型的建立及其病理演變.中國實(shí)驗(yàn)動(dòng)物學(xué)報(bào)2009，5(17):351-353.

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［6］Waidner N.intratumor microwessel density as a prognostic factor in cancer.Am J pathol，1995，147:9-19.

［7］Nagashima M，AsanoG，Yoshino S.Imbalance in production between vascular endothelial growth factor and endostatin in patients with rheumatoid arthritis.JRheumatology，2000，27(10):2339.

［8］Numasaki M，F(xiàn)ukushi J，Ono M，et al Interleukin-17 promotes angiogenesis and tumor growth.Blood，2003，101(7):735-738.

［9］王峰，黃安斌.IL-17在類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎中的作用.國際骨科學(xué)雜志，2006，5(27):301-306.