張麗萍，李 秋，舒 鷹，李云雷，陳成水

(溫州醫(yī)學(xué)院附屬第一醫(yī)院呼吸內(nèi)科，浙江溫州 325000)

肺動(dòng)脈高壓(pulmonary arterial hypertension，PAH)是以肺小動(dòng)脈的血管痙攣、內(nèi)膜增生和重構(gòu)及微血栓形成為主要特征的一種疾?。?］，患者最終常因右心衰竭而死亡。離體實(shí)驗(yàn)研究表明，慢性低氧時(shí)大鼠肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞線粒體能夠感受血氧的下降，引起線粒體膜電位的去極化，并通過(guò)一系列途徑促進(jìn)細(xì)胞增殖和抑制細(xì)胞凋亡，而線粒體膜上ATP敏感鉀通道特異性抑制劑5-羥基癸酸鹽(5-hydroxydecanoate，5-HD)能夠降低線粒體膜電位最終使肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞凋亡增多以及增殖減少［2－3］。炎癥機(jī)制在PAH的發(fā)生發(fā)展中起著重要的作用，然而目前尚無(wú)5-HD能通過(guò)調(diào)節(jié)外周及肺組織中的某些炎癥因子及趨化因子而降低肺動(dòng)脈壓的報(bào)道。本研究通過(guò)對(duì)低氧性PAH大鼠血清及肺組織炎癥指標(biāo)及肺動(dòng)脈壓力和血管結(jié)構(gòu)的檢測(cè)，探討5-HD對(duì)大鼠PAH影響的機(jī)制和其對(duì)炎癥的作用，為PAH和肺源性心臟病新的防治方法的探索提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物

健康清潔級(jí)雄性SD大鼠24只(由上海實(shí)驗(yàn)動(dòng)物購(gòu)買(mǎi)中心提供)，體質(zhì)量200～250 g。清潔級(jí)環(huán)境飼養(yǎng)，室溫控制在22～25℃，濕度控制在40% ～70%，顆粒飼料喂養(yǎng)，自由飲水。

1.2 試劑及儀器

5-HD(美國(guó)Sigma公司)，白細(xì)胞介素6(interleukin 6，IL-6)，IL-8，巨噬細(xì)胞炎癥蛋白(macrophage inflammatory protein，MIP)-1a及單核細(xì)胞趨化蛋白(monocyte chemoattractant protein，MCP)-1 ELISA 試劑盒(武漢華美生物技術(shù)有限公司)，1%NP-40裂解液(江蘇碧云天生物科技公司)，IL-6，MCP-1山羊多克隆抗體(美國(guó)Santa公司)，超敏即用型二步法(非生物素)檢測(cè)試劑盒PV-9003及DAB顯色試劑盒(北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司)，酶標(biāo)儀(美國(guó)Biotek公司)，MedLab生物數(shù)據(jù)記錄分析系統(tǒng)(南京美易科技有限公司)，Image-pro plus6.0圖像采集系統(tǒng)(江蘇省捷達(dá)科技發(fā)展有限公司)。

1.3 動(dòng)物分組及模型制備

適應(yīng)環(huán)境1周后，24只大鼠隨機(jī)分成正常對(duì)照組、低氧模型組及低氧+5-HD組。將低氧模型組和低氧+5-HD組在常壓低氧(9.5% ～10.5%)氧艙中進(jìn)行低氧處理，采用間斷性常壓低氧模型，每天進(jìn)行低氧處理8 h，每周6 d，艙內(nèi)水分用無(wú)水氯化鈣吸收，二氧化碳用鈉石灰吸收。1周后，低氧模型組每天sc給予PBS 5 mg·kg－1溶液，低氧+5-HD組大鼠每天先sc給予5-HD 5 mg·kg－1，再進(jìn)入低氧艙，連續(xù)3周。

1.4 血流動(dòng)力學(xué)指標(biāo)及右心室肥厚指數(shù)的計(jì)算

大鼠ip給予5%水合氯醛400 mg·kg－1溶液行全身麻醉，然后將大鼠仰臥固定，分離右頸外靜脈，采用灌有肝素鈉溶液的聚乙烯導(dǎo)管，自右頸外靜脈插入，并將插管緩慢推入右心室進(jìn)而插入肺動(dòng)脈內(nèi)，用YL-4型壓力傳感器，將信號(hào)聯(lián)入MedLab生物數(shù)據(jù)記錄分析系統(tǒng)，測(cè)定平均肺動(dòng)脈壓(mean pulmonary arterial pressure，mPAP)。采血后，開(kāi)胸取出心臟，剪去左右心房、心耳、血管末端及其周?chē)慕M織后，沿肺動(dòng)脈出口處剪開(kāi)右心室，其余為左心室和室間隔組織，然后分別稱(chēng)重，按公式計(jì)算右心肥厚指數(shù)(right ventricular hypertrophy index，RVHI)，RVHI=右心室質(zhì)量/(左心室質(zhì)量+室間隔組織質(zhì)量)。

1.5 生物標(biāo)本收集及處理

測(cè)壓完畢后，立即右心室取靜脈血3 ml，以700×g，4℃離心10 min后取上清液，－70℃冰箱保存，待測(cè)IL-6，IL-8，MIP-1a及MCP-1濃度。

處死大鼠，取右下肺組織，濾紙吸去表面的血跡和水分，用電子天平稱(chēng)取肺組織約200 mg后放入－70℃冰箱中備用。所有的標(biāo)本收集完畢后，取出肺組織復(fù)溫，剪碎，用1%NP-40裂解液裂解制備成肺組織勻漿，以6000×g，4℃離心5 min后，留取上清液待測(cè)IL-6，IL-8，MIP-1a及MCP-1濃度。

1.6 肺血管形態(tài)學(xué)分析

取左下肺組織，置于4%多聚甲醛溶液中固定，常規(guī)脫水、石蠟包埋、切片(3 μm)。在蘇木素-伊紅(HE)染色切片上，光鏡下觀察肺組織與肺動(dòng)脈形態(tài)學(xué)改變，選取斷面較圓的直徑20～150 μm的肺細(xì)小動(dòng)脈，用圖像分析軟件測(cè)定肺動(dòng)脈相對(duì)中膜厚度(pulmonary artery medial thickness，PAMT)。

1.7 血清及肺中 IL-6，IL-8，MIP-1a及 MCP-1濃度測(cè)定

采用雙抗體夾心酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)法測(cè)定，操作步驟嚴(yán)格按照說(shuō)明書(shū)進(jìn)行，用酶標(biāo)儀測(cè)定波長(zhǎng)450 nm吸光度值(absorbance，A)。

1.8 免疫組化法測(cè)定肺動(dòng)脈和支氣管中IL-6和MCP-1水平

免疫細(xì)胞化學(xué)染色采用超敏即用型二步法，按照PV-9003試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行，并用二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色。每種一抗的稀釋度均為1∶100。正常對(duì)照組用PBS代替一抗。細(xì)胞質(zhì)染成棕黃色為陽(yáng)性細(xì)胞。每一標(biāo)本在肺動(dòng)脈及細(xì)小支氣管各隨機(jī)選取5個(gè)視野，用Image-pro plus6.0圖像分析軟件測(cè)定陽(yáng)性產(chǎn)物的A值。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 5-羥基癸酸鹽對(duì)低氧性肺動(dòng)脈高壓大鼠血流動(dòng)力學(xué)指標(biāo)及右心肥厚指數(shù)的影響

與正常對(duì)照組相比，低氧模型組mPAP及RVHI顯著升高(P＜0.05);與低氧模型組相比，低氧+5-HD組壓及 RVHI顯著降低(P＜0.05)，基本恢復(fù)至正常對(duì)照組水平。表明5-HD能降低大鼠的PAH及 RVHI(表1)。

表15-羥基癸酸鹽(5-HD)對(duì)低氧性肺動(dòng)脈高壓(PAH)大鼠肺動(dòng)脈平均壓(mPAP)和右心肥厚指數(shù)(RVHI)的影響Tab.1 Effect of 5-hydroxydecanoate(5-HD)on mean pulmonary arterial pressure(mPAP)and right ventricular hypertrophy index(RVHI)in hypoxia-induced pulmonary arterial hypertension(PAH)rats

2.2 5-羥基癸酸鹽對(duì)低氧性PAH大鼠肺小血管組織形態(tài)的影響

光鏡下觀察HE染色肺組織切片顯示，正常組大鼠肺小動(dòng)脈管壁較薄，管腔較大(圖1A);低氧模型組大鼠肺小動(dòng)脈中膜平滑肌細(xì)胞顯著增生，管壁明顯增厚，管腔明顯狹窄，出現(xiàn)了肺血管重構(gòu)現(xiàn)象(圖1B);而低氧+5-HD組大鼠肺小動(dòng)脈中膜平滑肌細(xì)胞增殖受抑，管壁明顯變薄，管腔變大，肺血管重構(gòu)程度較低氧模型組明顯減輕(圖1C)。肺小動(dòng)脈圖像分析結(jié)果顯示，低氧模型組PAMT為0.311±0.030，較正常對(duì)照組0.169±0.033顯著升高(n=8，P ＜0.05)，與低氧模型組比較，5-HD組PAMT的0.197±0.027顯著降低(P ＜0.05)。

2.3 5-HD對(duì)低氧性大鼠血清及肺勻漿中 IL-6，IL-8，MIP-1a和MCP-1水平的影響

如表2和表3所示，與正常對(duì)照組相比，低氧模型組大鼠血清IL-6，IL-8，MIP-1a，MCP-1水平均顯著升高(P＜0.05);與低氧模型組相比，而5-HD組大鼠血清IL-8，MIP-1a，MCP-1水平顯著降低(P＜0.05)，但I(xiàn)L-6水平與低氧模型組比較無(wú)明顯差異;在肺勻漿中各組大鼠的IL-6，IL-8，MIP-1a，MCP-1水平均無(wú)明顯差異。表明5-HD能降低PAH大鼠循環(huán)血中IL-8，MIP-1a和MCP-1水平。

2.4 5-HD對(duì)肺動(dòng)脈和支氣管中IL-6和MCP-1的影響

低氧模型組肺動(dòng)脈中IL-6和MCP-1表達(dá)水平明顯高于正常對(duì)照組(P＜0.05)，5-HD組肺動(dòng)脈中IL-6，MCP-1表達(dá)水平與低氧模型組比較無(wú)明顯差異，但均有下降趨勢(shì)(圖2A，圖3A，表4)。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果還顯示，低氧模型組支氣管IL-6表達(dá)水平明顯高于正常對(duì)照組(P＜0.05)，而5-HD組支氣管IL-6表達(dá)水平與低氧模型組比較無(wú)明顯差異;各組支氣管MCP-1表達(dá)水平差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(圖2B，圖3B，表4和表5)。

圖1 5-HD對(duì)低氧性PAH大鼠肺動(dòng)脈形態(tài)的影響 (HE，×200).A:正常對(duì)照;B:低氧模型;C:低氧+5-HD.Fig.1 Effect of 5-HD on pulmonary artery histopathology in hypoxia-induced PAH rats(HE，×200).

表25-HD對(duì)低氧性PAH大鼠血清中白細(xì)胞介素IL-6，IL-8，巨噬細(xì)胞炎癥蛋白(MIP)-1a和單核細(xì)胞趨化蛋白(MCP)-1水平的影響Tab.2 Effect of 5-HD on interleukin 6(IL-6)，IL-8，macrophage inflammatory protein(MIP)-1a and monocyte chemoattractant protein(MCP)-1 in the serum of hypoxia-induced PAH rats

表35-HD對(duì)低氧性PAH大鼠肺中IL-6，IL-8，MIP-1a和MCP-1水平的影響Tab.3 Effect of 5-HD on IL-6，IL-8，MIP-1a and MCP-1 in the lungs of hypoxia-induced PAH rats

圖25-HD對(duì)低氧性PAH大鼠肺動(dòng)脈(A)及支氣管(B)中IL-6水平的影響 (DAB ×400).棕黃色陽(yáng)性表達(dá)細(xì)胞.1:正常對(duì)照組;2:低氧模型組;3:低氧+5-HD組.Fig.2 Effect of 5-HD on the IL-6 level of pulmonary artery(A)and bronchia(B)in hypoxia-induced PAH rats by immunohistochemistry(DAB ×400).

圖35-HD對(duì)低氧性PAH大鼠肺動(dòng)脈(A)及支氣管(B)中MCP-1表達(dá)的影響.(DAB ×400).棕黃色陽(yáng)性表達(dá)細(xì)胞.1:正常對(duì)照組;2:低氧組;3:低氧+5-HD組.Fig.3 Effect of 5-HD on the MCP-1 level of pulmonary artery(A)and bronchia(B)in hypoxia-induced PAH rats by immunohistochemistry(DAB ×400).

表45-HD對(duì)低氧性PAH大鼠肺動(dòng)脈中IL-6和MCP-1水平的影響Tab.4 Effect of 5-HD on IL-6 and MCP-1 in pulmonary artery of hypoxia-induced PAH rats

動(dòng)物分組處理見(jiàn)表1.采用超敏即用二步法測(cè)定肺動(dòng)脈中炎癥因子

表55-HD對(duì)低氧性PAH大鼠支氣管中IL-6和MCP-1水平的影響Tab.5 Effect of 5-HD on IL-6 and MCP-1 levels in bronchia of hypoxia-induced PAH rats

3 討論

肺血管重構(gòu)是低氧引起的PAH中晚期的主要表現(xiàn)，是由于血管壁細(xì)胞增殖和凋亡失衡所致［4］。內(nèi)皮功能的失調(diào)是PAH的特征性表現(xiàn)，內(nèi)皮功能失調(diào)導(dǎo)致血管舒張因子和收縮因子平衡失調(diào)，影響肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞，使血栓形成及炎癥細(xì)胞因子產(chǎn)生［5］，導(dǎo)致肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞發(fā)生增殖，使管壁增厚，管腔狹窄。本實(shí)驗(yàn)成功復(fù)制了低氧性PAH的模型，表現(xiàn)為mPAP增高，肺小動(dòng)脈管壁增厚，管腔變小，右心室肥厚。

已有大量證據(jù)支持炎癥機(jī)制參與PAH的病理生理過(guò)程［6－7］。PAH患者的循環(huán)血IL-1和IL-6等炎癥細(xì)胞因子及MIP-1a，MCP-1，T細(xì)胞激活分泌調(diào)節(jié)因子和表皮可溶性趨化因子等趨化因子的水平升高，周?chē)苡辛馨图?xì)胞和吞噬細(xì)胞等炎癥細(xì)胞的浸潤(rùn)［8－10］。IL-6是一種由內(nèi)皮細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和成纖維細(xì)胞等產(chǎn)生和分泌的多功能的炎癥前細(xì)胞因子，在PAH形成過(guò)程中有調(diào)節(jié)肺血管炎癥及重塑的作用。IL-8是重要的趨化和激活多形核中性粒細(xì)胞的細(xì)胞因子，能夠激活中性粒細(xì)胞和趨化吸引中性粒細(xì)胞到炎癥部位，觸發(fā)脫顆粒和表面黏附分子的表達(dá)及活性氧分子產(chǎn)物的釋放，是中性粒細(xì)胞激活和遷移的重要調(diào)節(jié)因子。MIP-1a和MCP-1均屬于趨化因子家族中成員，由內(nèi)皮細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞和巨噬細(xì)胞等炎癥細(xì)胞分泌，能夠促使單核細(xì)胞由外周循環(huán)遷移至炎癥部位聚集并激活，加重局部炎癥反應(yīng)。MIP-1a一方面可通過(guò)調(diào)節(jié)炎癥過(guò)程促使PAH的形成，另一方面通過(guò)促進(jìn)血管生成而促使PAH基礎(chǔ)病理形成［11］。本研究結(jié)果顯示，低氧模型組血清中IL-6，IL-8，MIP-1a和MCP-1水平均明顯高于正常對(duì)照組，提示低氧可加重肺循環(huán)炎癥反應(yīng)，引起循環(huán)血中炎癥因子及趨化因子表達(dá)增加，這與國(guó)外的多項(xiàng)研究結(jié)果相符［6，12－13］。

研究顯示，在機(jī)體低氧的情況下，mitoKATP通道開(kāi)放，K+內(nèi)流，線粒體膜去極化，從而影響細(xì)胞氧自由基、細(xì)胞色素C等的生成和分配及多種蛋白激酶或轉(zhuǎn)錄因子的活性，抑制細(xì)胞凋亡［14－15］。前期在體實(shí)驗(yàn)已經(jīng)證實(shí)，5-HD能降低低氧引起的大鼠PAH及肺血管重構(gòu)［16］。但對(duì)于5-HD是如何降低在體大鼠PAH的機(jī)制尚不明確。本研究結(jié)果顯示，應(yīng)用5-HD能顯著降低低氧引起的大鼠肺動(dòng)脈平均壓及RVHI，并顯著降低血清中IL-8，MIP-1a和MCP-1水平。5-HD可能通過(guò)抑制某些趨化因子的分泌，減輕低氧引起的PAH大鼠的炎癥反應(yīng)。肺組織勻漿中IL-6，IL-8，MIP-1a和MCP-1水平在各組中的表達(dá)未見(jiàn)明顯差別，提示PAH大鼠總體炎癥因子的水平主要取決于循環(huán)血而并非由肺部決定。

免疫組化研究結(jié)果顯示，低氧能誘導(dǎo)肺動(dòng)脈IL-6和MCP-1表達(dá)增加，這與以往實(shí)驗(yàn)結(jié)果符合［17］，5-HD干預(yù)后其表達(dá)有所下降。低氧還能誘導(dǎo)大鼠支氣管中IL-6表達(dá)增加，而5-HD并不能減少其在支氣管的表達(dá);并發(fā)現(xiàn)MCP-1對(duì)支氣管無(wú)顯著影響。

綜上所述，目前研究表明，mitoKATP的抑制劑5-HD對(duì)在體大鼠PAH具有一定的抗炎作用。5-HD可能具有有效降低低氧性PAH大鼠循環(huán)血中IL-8，MIP-1a和MCP-1水平，延緩PAH的發(fā)生，降低PAH的嚴(yán)重程度。但由于目前5-HD在PAH中的研究仍屬較少，其具體機(jī)制及對(duì)其他器官的作用有待進(jìn)一步研究和證實(shí)。

［1］ Jeffery TK，Morrell NW.Molecular and cellular basis of pulmonary vascular remodeling in pulmonary hypertension［J］.Prog Cardiovasc Dis，2002，45(3):173-202.

［2］ 胡紅玲，汪 濤，張珍祥，趙建平，徐永健.線粒體膜電位對(duì)缺氧人肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞內(nèi)氧自由基的變化及細(xì)胞增殖的作用［J］.中華結(jié)核和呼吸雜志，2006，29(11):727-730.

［3］ Wang T，Zhang ZX，Xu YJ，Hu QH.5-Hydroxydecanoate inhibits proliferation of hypoxic human pulmonary artery smooth muscle cells by blocking mitochondrial K(ATP)channels［J］.Acta Pharmacol Sin，2007，28(10):1531-1540.

［4］ Prabha M，Jin HF，Tian Y，Tang CS，DU JB.Mechanisms responsible for pulmonary hypertension［J］.Chin Med J(Engl)，2008，121(24):2604-2609.

［5］ Morrell NW，Adnot S，Archer SL，Dupuis J，Jones PL，MacLean MR，et al.Cellular and molecular basis of pulmonary arterial hypertension［J］.J Am Coll Cardiol，2009，54(1 Suppl):S20-S31.

［6］ Tuder RM，Voelkel NF.Pulmonary hypertension and inflammation［J］.J Lab Clin Med，1998，132(1):16-24.

［7］ Humbert M，Monti G，Brenot F，Sitbon O，Portier A，Grangeot-Keros L，et al.Increased interleukin-1 and interleukin-6 serum concentrations in severe primary pulmonary hypertension［J］.Am J Respir Crit Care Med，1995，151(5):1628-1631.

［8］ Savale L，Tu L，Rideau D，Izziki M，Maitre B，Adnot S，et al.Impact of interleukin-6 on hypoxia-induced pulmonary hypertension and lung inflammation in mice［J］.Respir Res，2009，10:6.

［9］ Dorfmüller P，Zarka V，Durand-Gasselin I，Monti G，Balabanian K，Garcia G，et al.Chemokine RANTES in severe pulmonary arterial hypertension［J］.Am J Respir Crit Care Med，2002，165(4):534-539.

［10］ Balabanian K，F(xiàn)oussat A，Dorfmüller P，Durand-Gasselin I，Capel F，Bouchet-Delbos L，et al.CX(3)C chemokine fractalkine in pulmonary arterial hypertension［J］.Am J Respir Crit Care Med，2002，165(10):1419-1425.

［11］ Pellegrino A，Vacca A，Scavelli C，Dammacco F.Chemokines and tumors［J］.Recent Prog Med，2002，93(11):642-654.

［12］ Itoh T，Nagaya N，Ishibashi-Ueda H，Kyotani S，Oya H，Sakamaki F，et al.Increased plasma monocyte chemoattractant protein-1 level in idiopathic pulmonary arterial hypertension［J］.Respirology，2006，11(2):158-163.

［13］ Sanchez O，Marcos E，Perros F，F(xiàn)adel E，Tu L，Humbert M，et al.Role of endothelium-derived CC chemokine ligand 2 in idiopathic pulmonary arterial hypertension［J］.Am J Respir Crit Care Med，2007，176(10):1041-1047.

［14］ Xu MF，Wang YG，Ayub A，Ashraf M.Mitochondrial KATPchannel activation reduces anoxic injury by restoring mitochondrial membrane potential［J］.Am J Physiol Heart Circ Physiol，2001，281(3):1295-1303.

［15］ Platoshyn O， Zhang S， McDaniel SS， Yuan JX.Cytochrome c activates K+channels before inducing apoptosis［J］.Am J Physiol Cell Physiol，2002，283(4):C1298-C1305.

［16］ 董 莉，朱海萍，李云雷，李 秋，陳成水.5-差勁基癸酸鹽對(duì)低氧肺動(dòng)脈高壓大鼠肺血管重建的影響及其機(jī)制［J］.溫州醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，2010，40(15):445-449.

［17］ Yan SF，Tritto I，Pinsky D，Liao H，Huang J，F(xiàn)uller G，et al.Induction of interleukin 6(IL-6)by hypoxia in vascular cells.Central role of the binding site for nuclear factor-IL-6［J］.J Biol Chem，1995，270(19):11463-11471.