敬海明，劉建中，高文暉，趙超英，馬 玲，李國君(1.首都醫(yī)科大學(xué)公共衛(wèi)生與家庭醫(yī)學(xué)學(xué)院，北京 100069;.北京市疾病預(yù)防控制中心北京市預(yù)防醫(yī)學(xué)研究中心北京市食物中毒診斷溯源技術(shù)重點實驗室，北京 100013)

錳是機體所必需的一種微量元素，但過量可引起暴露時又可引起多巴胺能神經(jīng)元的損傷，對其機制的探討，一直以來都是人們研究的熱點。尤其是近年來，甲基環(huán)戊二烯三羰基錳(methyl－cyclopentadienyl－manganese－tricarbonyl，MMT)作為汽油添加劑的使用而引起的大氣錳(MnCl2)污染日益嚴重，逐漸引起國內(nèi)外學(xué)者對長期低劑量錳暴露研究的重視［1］。有研究報道稱，血錳過高時主要通過由脈絡(luò)叢上皮細胞所形成的血－腦脊液屏障(blood－cerebrospinal fluid barrier，BCB)向腦內(nèi)轉(zhuǎn)運［2］。BCB 作為錳過量暴露時向腦內(nèi)轉(zhuǎn)運的重要途徑，其損傷發(fā)生在多巴胺能神經(jīng)元之前，研究并掌握錳早期對于BCB的毒性損傷作用及其機制，可以為今后制定職業(yè)與環(huán)境因素錳及其化合物所致神經(jīng)退行性疾病的早期有效防治措施提供理論依據(jù)。本研究通過觀察脈絡(luò)叢組織的病理形態(tài)學(xué)改變及BCB的損傷指標(biāo)腦脊液(cerebrospinal fluid，CSF)白蛋白指數(shù)［3］探討氯化錳對脈絡(luò)叢(choroid plexus，CP)的損傷作用。

1 材料與方法

1.1 試劑和儀器

MnCl2，純度＞99%，購自美國Sigma公司;白蛋白測試盒(南京建成生物工程研究所);蛋白標(biāo)準(zhǔn)液(南京建成生物工程研究所);KT－354大鼠微量白蛋白ELISA試劑盒(美國Kamiya生物公司);680型全自動酶標(biāo)儀(美國 Bio－Rad公司);SCOT－Ⅱ BT224型半自動生化分析儀(意大利Biotecnica公司);CH30生物相差顯微鏡(日本Olympus公司);圖像采集分析軟件UV－G顯微粒度分析系統(tǒng)(北京和眾視野科技有限公司);JEM－1230透射電子顯微鏡(日本Jeol公司);石蠟包埋機、切片機、展片機與自動染色機均為Leica公司產(chǎn)品。

1.2 動物分組與處理

60只5周齡大的SPF級健康雄性SD大鼠，115～135 g，由軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院提供，動物許可證號:SCXK－1(軍)2007－004，隨機分成 6 組，每組 10只，分別為氯化錳30 d組、氯化錳90 d組及氯化錳90 d+30 d恢復(fù)組與相應(yīng)的對照組(氯化錳30 d對照組、氯化錳90 d對照組、氯化錳90 d+30 d恢復(fù)對照組)。氯化錳組 ip給予無水氯化錳 6 mg(Mn)·kg－1染毒，每周染毒 6 d，周日停染，相應(yīng)的對照組給予相同劑量的生理鹽水處理。

1.3 樣本采集

各時間點染毒結(jié)束后，經(jīng)腹腔麻醉后消毒頸部皮膚，用0.45 mm×20 mm的蝶形針經(jīng)環(huán)枕膜穿刺待有落空感時見清亮CSF流出，以注射器輕抽CSF約100 μl注入預(yù)冷的Eppendorf管;從下腔靜脈抽取血液6～8 ml，注入無肝素處理的血液收集管，室溫放置至少0.5 h，600×g離心30 min，分離血清;采集實驗組與正常對照組動物雙側(cè)側(cè)腦室的脈絡(luò)叢組織。

1.4 血清白蛋白(SALB)與腦脊液白蛋白(CALB)的檢測及CALB指數(shù)的計算

SALB采用溴甲酚綠法在BT224型半自動生化分析儀上測定，CALB采用大鼠微量白蛋白ELISA試劑盒按說明書操作后以全自動酶標(biāo)儀進行測定，CALB指數(shù)=CALB/(SALB×10－3)。

1.5 光鏡、電鏡下觀察脈絡(luò)叢細胞形態(tài)

各組取3只大鼠的脈絡(luò)叢用生理鹽水徹底沖洗后合并，常規(guī)的4%甲醛固定，石蠟包埋，HE染色，制作成病理切片標(biāo)本，每組至少10張，光鏡下觀察組織和細胞形態(tài)變化。

1.6 透射電鏡觀察脈絡(luò)叢上皮細胞超微結(jié)構(gòu)

各組分別將2只大鼠的脈絡(luò)叢用2.5%戊二醛固定，再用1%鋨酸后固定，通過丙酮系列(30%，50%，70%，90%，100%)脫水，包埋在 Epon812中，制成超薄切片，用檸檬酸鉛及醋酸鈾染色，在透射電鏡下觀察細胞超微結(jié)構(gòu)的變化(每組至少觀察5張)。

1.7 統(tǒng)計學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 錳對大鼠腦脊液白蛋白，血清白蛋白及腦脊液白蛋白指數(shù)的影響

氯化錳組CALB與CALB指數(shù)與其相應(yīng)的對照組比較均明顯升高(P＜0.05);氯化錳30 d組的CALB與CALB指數(shù)低于氯化錳90 d和氯化錳90 d+30 d恢復(fù)組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)，氯化錳90 d組CALB與CALB指數(shù)低于氯化錳90 d+30 d恢復(fù)組，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義(表1)。

表1 錳對大鼠腦脊液白蛋白(CALB)，血清白蛋白(SALB)及腦脊液白蛋白(CALB)指數(shù)的影響Tab.1 Effect of manganese on CSF albumin(CALB)，serum albumin(SALB)and CSF albumin index(CALB index)in rats

2.2 錳對大鼠脈絡(luò)叢組織及上皮細胞形態(tài)的影響

各對照組脈絡(luò)叢組織結(jié)構(gòu)清晰，上皮細胞排列整齊，細胞核大而圓，染色質(zhì)均勻，位于細胞中央，細胞質(zhì)染色較淺，細胞基底部可見毛細血管(圖1A)。染氯化錳30 d后，脈絡(luò)叢上皮細胞的排列開始出現(xiàn)紊亂，有的細胞核濃染變形，可見細胞腫大現(xiàn)象，脈絡(luò)叢上皮與其基底部的血管之間部分脫落(圖1B)。染氯化錳90 d后脈絡(luò)叢組織混亂，上皮細胞之間界限不清，細胞核大小不一，有的缺失，胞漿絮狀，血管與上皮之間完全脫落(圖1C)。染氯化錳90 d后無處理觀察30 d后脈絡(luò)叢組織的改變更加明顯，細胞萎縮，胞膜不清，細胞核發(fā)生濃縮、碎裂、溶解等，類似于“凋亡細胞”的死亡現(xiàn)象，細胞間的連接部分消失等(圖1D)。由此可見，隨染氯化錳時間的延長脈絡(luò)叢的損傷性改變逐漸加重，并且在脫離氯化錳接觸30 d后仍然表現(xiàn)為損傷持續(xù)性加重的特征。

2.3 錳對大鼠脈絡(luò)叢細胞超微結(jié)構(gòu)的影響

圖1 錳對大鼠脈絡(luò)叢病理組織學(xué)的影響 (HE ×100).分組處理見表1.A:氯化錳30 d對照組;B:氯化錳30 d組，脈絡(luò)叢上皮扁平，細胞排列紊亂;C:氯化錳90 d組，脈絡(luò)叢組織形態(tài)模糊不清，細胞核大小不一，有的缺失;D:氯化錳90 d+30 d恢復(fù)組，細胞胞膜不清，胞核濃縮、溶解，細胞間連接模糊.Fig.1 Effect of manganese on histopathological changes in choroid plexus of rats(HE ×100).

如圖2～圖4所示，各對照組側(cè)腦室的脈絡(luò)叢上皮細胞正常，核大而圓，胞質(zhì)內(nèi)線粒體豐富，上皮細胞間近游離端可見完整的緊密連接結(jié)構(gòu)，并且上皮細胞游離端多不規(guī)則，自質(zhì)膜衍生出許多微絨毛，排列整齊，上皮下為富含毛細血管的基質(zhì)。各氯化錳處理組脈絡(luò)叢上皮細胞均發(fā)生不同程度的改變，表現(xiàn)為暗細胞數(shù)增加，細胞核濃縮深染，核膜皺縮變形，細胞質(zhì)空泡增加，微絨毛缺失，溶酶體增加，粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腫脹，以及細胞間緊密連接間隙變寬、斷裂，甚至消失，隨染氯化錳時間延長，損害加重，并在脫離氯化錳接觸30 d后仍有進行性加重的趨勢，呈現(xiàn)出氯化錳毒性病程依賴性模式。

圖2 錳對大鼠脈絡(luò)叢上皮細胞細胞核(N)、線粒體(M)與溶酶體(L)的影響.分組處理見表1.A:氯化錳30 d對照組;B:氯化錳30 d組，胞核變小，核膜皺縮變形，線粒體空泡樣改變，溶酶體破裂變小;C:氯化錳90 d組，胞核皺縮變形，線粒體空泡樣改變，嵴有脫落現(xiàn)象，溶酶體破裂變小;D:氯化錳90 d+30 d恢復(fù)組，核膜皺縮，染色質(zhì)濃染，似凋亡，線粒體腫大，嵴脫落，可見大量空泡，溶酶體增加.Fig.2 Effect of manganese on nucleus(N)，mitochondria(M)and lysosome(L)in choroid plexus epithelia of rats.

圖3 錳對大鼠脈絡(luò)叢上皮細胞微絨毛(MV)的影響.分組處理見表1.A:氯化錳30 d對照組;B:氯化錳30 d組微絨毛腫大;C:氯化錳90 d組微絨毛排列紊亂;D:氯化錳90 d+30 d恢復(fù)組微絨毛缺失，排列紊亂.Fig.3 Effect of manganese on microvilli(MV)in choroid plexus epithelia of rats.

3 討論

BCB主要是由室管膜內(nèi)陷于第三、四腦室與側(cè)腦室分化形成的脈絡(luò)叢組織上皮細胞間的緊密連接所構(gòu)成，專司外周血循環(huán)與CSF循環(huán)之間的物質(zhì)轉(zhuǎn)運［4］。脈絡(luò)叢組織由脈絡(luò)叢上皮與富含有窗毛細血管的基質(zhì)構(gòu)成，其上皮細胞是立方形或矮柱形細胞，細胞表面有許多微絨毛，細胞核大而圓，胞質(zhì)內(nèi)有豐富的線粒體［5］。脈絡(luò)叢上皮為一具有活性的界面，不僅可以通過其表面的微絨毛分泌CSF，而且在保護腦組織免受一些血液中的內(nèi)源性與外源性有害物質(zhì)損害方面也起著非常重要的作用［4］。當(dāng)血液中的有毒物質(zhì)(如重金屬氯化錳等)水平增高時，脈絡(luò)叢可以通過結(jié)合蓄集的方式阻止其進入CSF［6］。但是，脈絡(luò)叢對外源性物質(zhì)的結(jié)合能力是有限的，當(dāng)有毒活性物質(zhì)蓄積到一定量時便會破壞脈絡(luò)叢的結(jié)構(gòu)和功能［7］，血清中有毒金屬與非金屬離子就失去了結(jié)合位點而不受限制地進入CSF［8］，使神經(jīng)系統(tǒng)的代謝及功能發(fā)生紊亂，并引起一系列神經(jīng)生理生化改變。

本研究應(yīng)用光鏡與透射電鏡觀察了氯化錳對脈絡(luò)叢的病理形態(tài)學(xué)影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)脈絡(luò)叢是氯化錳過量暴露時一個重要的靶部位，氯化錳可致脈絡(luò)叢上皮細胞發(fā)生不規(guī)則萎縮變小，微絨毛結(jié)構(gòu)紊亂、縮短，胞漿內(nèi)出現(xiàn)空泡、核質(zhì)凝聚，線粒體結(jié)構(gòu)破壞，細胞之間的緊密連接出現(xiàn)部分斷裂與消失等，并且這些改變隨染氯化錳時間的延長表現(xiàn)為加重的趨勢，即使在恢復(fù)期仍可進行性加重。說明錳可以蓄積在脈絡(luò)叢中，且脈絡(luò)叢蓄積錳的作用有一定的限度，當(dāng)超過限度時，可引起脈絡(luò)叢結(jié)構(gòu)變化影響其屏障功能完整性。

CSF中約90%的成分來源于脈絡(luò)叢組織的分泌［9］。腦脊液對腦組織具有支持、保護與營養(yǎng)作用，正常生理狀態(tài)下，其成分受BCB的嚴格調(diào)控而保持相對穩(wěn)定，但是，在腦組織發(fā)生老化以及神經(jīng)退行性疾病時CSF中的一些血源性蛋白分子含量會增加，可以作為反映BCB損傷的指數(shù)［10］，如CSF白蛋白指數(shù)等［11］。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，染氯化錳可以引起CALB濃度以及CALB指數(shù)升高，升高水平與染氯化錳時間長短以及脈絡(luò)叢組織的病理結(jié)構(gòu)改變呈正相關(guān)，說明CALB濃度及CALB指數(shù)可以作為判斷氯化錳對BCB損傷程度的參考指標(biāo)，可以為今后制定作為職業(yè)與環(huán)境因素的氯化錳及其化合物所致神經(jīng)退行性疾病的早期有效防治措施提供理論依據(jù)。

［1］ Pfeifer GD，Roper JM，Dorman D，Lynam DR.Health and environmental testing of manganese exhaust products from use of methylcyclopentadienyl manganese tricarbonyl in gasoline［J］.Sci Total Environ，2004，(334－335):397－408.

［2］ Murphy VA，Wadhwani KC，Smith QR，Rapoport SI.Saturable transport of manganese(Ⅱ)across the rat bloodbrain barrier［J］.J Neurochem，1991，57(3):948－954.

［3］ Okamura T，Ishibashi N，Zurakowski D，Jonas RA.Cardiopulmonary bypass increases permeability of the blood－cerebrospinal fluid barrier［J］.Ann Thorac Surg，2010，89(1):187－194.

［4］ Strazielle N，Ghersi－Egea JF.Choroid plexus in the central nervous system:biology and physiopathology［J］.J Neuropathol Exp Neurol，2000，59(7):561－574.

［5］ Mathew TC.Diversity in the surface morphology of adjacent epithelial cells of the choroid plexus:an ultrastructural analysis［J］.Mol Cell Biochem，2007，301(1－2):235－239.

［6］ Ingersoll RT，Montgomery EB Jr，Aposhian HV.Central nervous system toxicity of manganese.Ⅰ.Inhibition of spontaneous motor activity in rats after intrathecal ad－ministration of manganese chloride［J］.Fundam Appl Toxicol，1995，27(1):106－113.

［7］ Zheng W，Aschner M，Ghersi－Egea JF.Brain barrier systems:a new frontier in metal neurotoxicological research［J］.Toxicol Appl Pharmacol，2003，192(1):1－11.

［8］ Zheng W，Perry DF，Nelson DL，Aposhian HV.Choroid plexus protects cerebrospinal fluid against toxic metals［J］.FASEB J，1991，5(8):2188－2193.

［9］ Rubenstein E.Relationship of senescence of cerebrospinal fluid circulatory system to dementias of the aged［J］.Lancet，1998，351(9098):283－285.

［10］ Korolainen MA，Nyman TA，Nyyss?nen P，Hartikainen ES，Pirttil? T.Multiplexed proteomic analysis of oxidation and concentrations of cerebrospinal fluid proteins in Alzheimer disease［J］.Clin Chem，2007，53(4):657－665.

［11］ Chen RL，Chen CP，Preston JE.Elevation of CSF albumin in old sheep:relations to CSF turnover and albumin extraction at blood－CSF barrier［J］.J Neurochem，2010，113(5):1230－1239.