孫 蓉，楊 倩

(1.山東省中醫(yī)藥研究院藥理學(xué)研究室，山東濟南 250014;2.山東中醫(yī)藥大學(xué)，山東濟南 250355)

柴胡揮發(fā)油(volatile oil from Bupleurum chinese)是柴胡的主要解熱、抗炎活性成分，其制劑柴胡注射液和柴胡口服液在臨床應(yīng)用中卻有大量不良反應(yīng)報道，主要有過敏反應(yīng)、急性腎衰竭、肺水腫和肝損害等［1－4］。據(jù)制備工藝分析，其不良反應(yīng)的發(fā)生可能與其中所含的柴胡揮發(fā)油有關(guān)。大、小鼠ig給予一定劑量的柴胡揮發(fā)油，肉眼可見肝體積增大、色暗紅、邊緣變鈍等大體病理學(xué)變化［5］。本實驗室既往研究發(fā)現(xiàn)柴胡不同提取物均可造成大鼠肝毒性損傷，氧化應(yīng)激損傷是其重要的損傷途徑［6－8］。本課題研究表明，連續(xù)10 d ig給予大鼠柴胡揮發(fā)油0.25 ～0.50 ml·kg－1可造成大鼠明顯肝毒性損傷，表現(xiàn)為血清谷草轉(zhuǎn)氨酶(glutamic oxaloacetic transaminase，GOT)和谷丙轉(zhuǎn)氨酶(glutamic pyruvic transaminase，GPT)水平明顯升高，體質(zhì)量明顯降低，肝體比值明顯升高，并呈現(xiàn)明顯的量-效關(guān)系，隨給藥劑量增加上述改變幅度增大［9］。氧化應(yīng)激損傷也是柴胡揮發(fā)油肝毒性機制之一［9］，氧化應(yīng)激與線粒體功能障礙密切相關(guān)，線粒體既是活性氧產(chǎn)生的主要部位又是活性氧攻擊的首要靶點［10］。且越來越多的證據(jù)表明，在肝病變過程中伴隨有線粒體功能和形態(tài)的改變［11］，本文旨在探討柴胡揮發(fā)油對大鼠肝線粒體能量代謝的影響為闡明其肝毒性機制提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 藥物

柴胡藥材購自河北安國藥材市場，經(jīng)山東中醫(yī)藥大學(xué)生藥學(xué)專家張芳鑒定為傘形科植物柴胡(B.chinese DC.)的干燥根，經(jīng)檢驗為藥典合格藥材。

稱取定量柴胡藥材加12倍量水浸泡15 h，用揮發(fā)油提取裝置加熱回流提取5 h，收集揮發(fā)油(相當(dāng)于生藥量487.39 kg·L－1)置冰箱內(nèi)備用。臨用前加等量吐溫80乳化后加蒸餾水配稀釋至所需濃度。

1.2 試劑與試劑盒

Tris堿購自Sigma公司，其他試劑均購自國藥集團上?；瘜W(xué)試劑公司。ATP測試盒(100T)，批號均為20080710，購自南京建成生物工程研究所。

1.3 儀器

DZTW型調(diào)溫電熱套，北京市永光明醫(yī)療儀器廠;T-9601 DDL-5低速冷凍離心機，上海安亭科學(xué)儀器廠;UNICO2100紫外可見分光光度計美國尤尼柯(上海儀器有限公司);Clark氧電極，YSI Model 53氧氣調(diào)節(jié)器，美國金泉(YSI);RF-510LC熒光分光光度計，日本島津公司;JYD-IA型溶氧測定儀江蘇江分電分析儀器有限公司。

1.4 動物給藥及樣品制備

SPF級Wistar大鼠，120只，雌雄各半，體質(zhì)量140～190 g，由山東大學(xué)實驗動物中心提供，動物許可證號:SCXK(魯)20030004。穩(wěn)定3 d后進入實驗，分別 ig 給予 0.42，0.28，0.19 ml·kg－1的柴胡揮發(fā)油，連續(xù) 15 d，體積均為 10 ml·kg－1，正常對照組ig給予同體積的蒸餾水。

末次藥后大鼠禁食12 h，眶靜脈叢取血，3000×g離心10 min，處死解剖取肝臟。取1 g肝組織放入預(yù)冷的生理鹽水中洗去污血，用小剪刀于冰浴的小燒杯中將肝組織剪成邊長為1～2 mm的小塊，加入5 ml預(yù)冷的分離介質(zhì)(蔗糖 0.25 mo1·L－1，Tris-HCl 0.005 mol·L－1，EDTA 0.001 mol·L－1，pH 7.5)，將剪好的組織塊轉(zhuǎn)移到預(yù)冷的玻璃勻漿器中，上下均勻勻漿10次，勻漿液于4℃條件下12 000×g離心20 min，棄上清，取其沉淀部分即為線粒體，再加入150 μl勻漿遞質(zhì)，用微量勻漿器勻漿，制成線粒體懸浮液。

1.5 觀察指標(biāo)及檢測方法

1.5.1 肝臟線粒體呼吸耗氧、呼吸控制率、磷氧比值

采用 Clark 氧電極法［12］，取反應(yīng)介質(zhì)(蔗糖0.225 mol·L－1，KCl 15 mmol·L－1，KH2PO415 mmol·L－1，Tris-HCl 50 mmol·L－1，EDTA 1 mmol·L－1，pH 7.5)2.9 ml，加入攪拌反應(yīng)杯中，恒溫30℃。加入線粒體混懸液0.1 ml，以琥珀酸(終濃度 10 mmol·L－1)為底物，反應(yīng) 1min 后加入 ADP 600 nmol·L－1，用 JYD-IA溶氧測定儀記錄線粒體氧化還原反應(yīng)曲線，計算呼吸耗氧量、呼吸控制率(respiratory control rate，RCR)和磷氧比值(phosphorus to oxygen index，P/O)。

1.5.2 ATP 含量［13］

將提取的完整線粒體混懸液按1∶1加裂解液混勻，保證線粒體膜可以被完全裂解。裂解后在4℃ 條件下12 000×g離心8 min，取上清，稀釋100倍待測。ATP標(biāo)準(zhǔn)溶液用超純水稀釋成0，0.1，1，10和100 nmol·L－1濃度梯度，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。加100 μl ATP 檢測工作液到檢測管中，在檢測管中加10 μl樣品，迅速用加樣器混勻，立即用弱光儀檢測，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計算出樣品中的 ATP 含量，以μmol·g－1表示。

1.5.3 ATP 酶活力

定磷法［14］測定ATP酶活力，ATP酶的活力單位以每小時每克蛋白分解ATP產(chǎn)生的1 mmol無機磷的量來表示，即 mmol·h－1·g－1蛋白。

1.6 統(tǒng)計學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 柴胡揮發(fā)油對大鼠肝線粒體呼吸功能的影響

與正常對照組比較，柴胡揮發(fā)油0.19，0.28和0.42 ml·kg－1組 RCR，P/O 和呼吸耗氧量均顯著降低，且有隨劑量增加不斷降低的趨勢(表1)。

表1 柴胡揮發(fā)油對大鼠肝線粒體耗氧量、呼吸抑制率(PCR)和磷與氧比值(P/O)的影響Tab.1 Effect of volatile oil from B.chinese on the respiratory oxygen uptake，respiratory control rate(PCR)and phosphorus to oxygen index(P/O)of hepatic mitochondrion in rats

2.2 柴胡揮發(fā)油對大鼠肝線粒體ATP含量的影響

與正常對照組比較，柴胡揮發(fā)油0.19，0.28和0.42 ml·kg－1組肝線粒體內(nèi) ATP 含量明顯降低，并隨劑量增加逐漸降低(P＜0.05)(表2)。

表2 柴胡揮發(fā)油對大鼠肝線粒體ATP含量的影響Tab.2 Effect of volatile oil from B.chinese on ATP contents in hepatic mitochondrion of rats

2.3 柴胡揮發(fā)油對大鼠肝線粒體ATP酶活性的影響

如表3所示，與正常對照組相比，柴胡揮發(fā)油0.19 ～ 0.42 mg·kg－1顯著降低 Na+-K+-ATP 酶、Mg2+-ATP酶、Ca2+-ATP酶活性，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P ＜0.05)。

表3 柴胡揮發(fā)油對大鼠肝線粒體ATP酶活性的影響Tab.3 Effect of volatile oil from B.chinese on hepatic mitochondrion activities of ATPases in rats

3 討論

肝是能量代謝的重要器官，含有豐富的線粒體，而線粒體是細(xì)胞有氧呼吸的基地和能量供應(yīng)的場所，細(xì)胞生命活動約95%的能量來自線粒體。肝損傷時線粒體是較早發(fā)生損害的細(xì)胞器之一，線粒體的呼吸功能以及氧化磷酸化功能受抑制，ATP合成減少，從而必然引起細(xì)胞能量代謝障礙并最終導(dǎo)致細(xì)胞死亡。

RCR是指ADP控制下的氧消耗速率與不受ADP控制的氧消耗速率的比值，是反映線粒體結(jié)構(gòu)完整性及氧化磷酸化耦聯(lián)程度的靈敏指標(biāo)［15］。P/O是指線粒體每消耗一摩爾氧原子時有多少摩爾的ADP磷酸化成ATP，反映了線粒體利用氧化釋放的能量來合成ATP的效率［15］。ATP作為機體內(nèi)各種生理活動最直接的供能物質(zhì)，它的產(chǎn)生依賴于ATP酶的活性。Na+-K+-ATP酶是維持線粒體膜流動性正常的關(guān)鍵酶，Ca2+-ATP酶、Mg2+-ATP酶是維持細(xì)胞內(nèi)鈣鎂平衡的重要物質(zhì)，Mg2+/Ca2+比值是反映細(xì)胞不可逆損傷的重要指標(biāo)［15］。本文研究結(jié)果表明，連續(xù)15 d給大鼠ig給予不同劑量的柴胡揮發(fā)油，肝線粒體PCR、P/O、呼吸耗氧量、ATP含量和ATP酶活性均明顯降低。提示柴胡揮發(fā)油通過降低肝線粒體氧化磷酸化效率、減少ATP合成，從而使ATP酶功能不足，ATP酶活性降低致線粒體膜流動性降低、結(jié)構(gòu)受損，從而造成肝細(xì)胞的不可逆損傷。

通過本研究可確認(rèn)抑制肝線粒體呼吸功能、影響肝能量代謝是柴胡揮發(fā)油致大鼠肝毒性損傷的一條途徑，因此，有必要對其可能存在的其他肝毒性機制進行研究，為闡明柴胡揮發(fā)油的肝毒性以及保證臨床安全應(yīng)用提供實驗依據(jù)，同時也為中藥肝毒性評價提供研究思路與技術(shù)支撐。

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