韋瀟湘，唐 深，王春雙，陳長艷，陸彩玲，郭松超，李習(xí)藝

(廣西醫(yī)科大學(xué)1.公共衛(wèi)生學(xué)院;2.基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院;廣西南寧 530021)

氫醌(hydroquinone，HQ)又名對苯二酚［C6H(OH)］，是苯在生物體內(nèi)的代謝產(chǎn)物，在苯血液毒性中發(fā)揮重要的作用，可導(dǎo)致再生障礙性貧血、骨髓異常增生綜合征、白血病及淋巴瘤等多種造血系統(tǒng)功能障礙，研究HQ血液毒性機制對探討苯的毒性機制具有重要的意義。前期研究發(fā)現(xiàn)，在人胚肺成纖維細胞MRC-5及人臍血單個核細胞中，HQ的毒性可能與過氧化物酶2-Cys過氧化物氧還蛋白(peroxiredoxins)(2-Cys Prxs)有關(guān)［1－2］。2-Cys Prxs是細胞內(nèi)一類抗氧化蛋白家族，它們都有兩個高度保守的具有氧化還原活性的半胱氨酸殘基，即過氧化活性的胱氨酸殘基cys51和還原活性的半胱氨酸殘基cys172。2-Cys Prxs在氧化應(yīng)激中發(fā)揮重要的作用［3］，保護細胞免受氧自由基損害，同時它們在細胞增殖與分化中也起著重要的作用［4］。HL-60細胞株是人前髓細胞株，其髓系祖細胞特性明顯，具有多向分化能力，在豆蔻酰佛波醇(phorbol 12-myristate 13-acetate，PMA)或二甲亞砜(DMSO)誘導(dǎo)下可分別向單核系或粒系分化，適用于粒系、單核系分化研究［5－6］。本實驗主要研究HQ對HL-60細胞向單核系、粒系分化的影響，并探討2-Cys Prxs在其中的作用。

1 材料與方法

1.1 細胞與試劑

HL-60細胞購自上海細胞生物所，IMDM培養(yǎng)基購自美國?？寺嶒炇夜?，PMA和HQ購自Sigma公司，硝基四氮唑藍(NBT)購自Sanland公司，Cell Counting Kit-8(CCK-8試劑盒)、顯影定影試劑盒購自碧云天生物技術(shù)研究所。cDNA合成試劑盒、PCR試劑盒與熒光定量 PCR引物購自沈陽TaKaRa公司;Trizol購自美國 Invitrogen公司，Western印跡抗體購自Santa Cruz公司及Fermantas公司，其余試劑為國產(chǎn)分析純。

1.2 細胞培養(yǎng)

HL-60細胞培養(yǎng)于IMDM培養(yǎng)基，含胎牛血淸200 ml·L－1，青霉素 100 kU·L－1，鏈霉素 100 mg·L－1。在37℃，含體積分數(shù)為0.05 CO2的培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)傳代。

1.3 HL-60 細胞染毒

根據(jù)前期實驗結(jié)果及文獻［2，5－6］，細胞分為正常對照組、PMA 20 nmol·L－1、PMA 20 nmol·L－1+HQ 1，5 和50 μmol·L－1，以及 1.25%DMSO對照、DMSO+HQ 1，5 和 50 μmol·L－1組，各組細胞數(shù)為1×109L－1。HQ用前用無血清IMDM配制，正常對照組加入相應(yīng)體積無血清IMDM。分別在48和96 h收集細胞。

1.4 細胞形態(tài)學(xué)觀察

取各個實驗組的HL-60細胞懸液5 μl推片晾干，乙醇 50 ml·L－1固定 5 min，乙醇 80 ml·L－1固定5 min后晾干，瑞氏-姬姆薩染液染色5～10 min沖洗晾干，光鏡下觀察。

1.5 NBT還原酶檢測HL-60細胞分化

收集各個實驗組的HL-60細胞，錐蟲(臺盼)藍檢測細胞活力，取200 μl含有1×1 O5個活細胞的細胞懸液，加入200 μl 1%NBT 溶液含終濃度為2 mg·L－1的佛波酯(PMA)混合，放入37℃孵育60 min，再將細胞離心后去除上清液，每份標本加入200 μl DMSO，在室溫下振蕩20 min，測波長570 nm的吸光度值(absorbance，A)［7－8］。A 值越大表明細胞分化程度越佳。

1.6 HL-60細胞增殖檢測

參照CCK-8試劑說明書收集各組HL-60細胞，棄原培養(yǎng)液，每組細胞加入含 CCK-8 100 ml·L－1的培養(yǎng)基，37℃繼續(xù)培養(yǎng)1 h后，測定A450nm。

1.7 熒光定量PCR檢測2-Cys Prxs基因表達

1.7.1 總 RNA 制備

離心收集各實驗組的細胞，棄培養(yǎng)液，加入1 ml Trizol，室溫放置 10 min，加 0.2 ml氯仿，振蕩 15 s，靜置3 min，4℃，12 000×g離心15 min，取水相加入0.5 ml異丙醇，室溫放置10 min，4℃，12 000 ×g離心10 min，75%乙醇洗滌干燥后溶于純焦碳酸二乙酯，紫外分光光度儀檢測提取總RNA的質(zhì)量和濃度。要求A260/A280在1.8～2.1范圍，并計算 RNA含量。

1.7.2 cDNA 的合成

反應(yīng)體系 20 μl，取隨機引物(100 μmol·L－1)1 μl，每一份標本取總 RNA 1 μg，RNA 酶抑制劑(40 kU·L－1)0.5 μl，dNTP 混合物 (各 10 μmol·L－1)1 μl，5 倍反應(yīng)緩沖液4 μl，逆轉(zhuǎn)錄酶100 U，加純焦碳酸二乙酯至 20 μl。按 42℃ 30 min，95℃ 2 min，進行逆轉(zhuǎn)錄。合成好的cDNA置于－20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.7.3 實時熒光定量 PCR檢測2-Cys Prxs基因表達

20 μl反應(yīng)體系中包括:上下游引物 10 μmol·L－1各 0.8 μl，SYBR ? Premix Ex TaqTM(2 × )10 μl，ROX Reference DyeⅡ(50 × )0.4 μl，雙蒸水 7 μl，cDNA標本1 μl。各基因擴增片段長度如下:PrxⅠ為141 bp，PrxⅡ為129 bp，PrxⅢ為98bp，PrxⅣ為75 bp，引物序列見表 1。按 95℃，30 s;40個循環(huán)(95℃，5 s;60℃，34 s)進行反應(yīng)，反應(yīng)結(jié)束后，儀器自動記錄每個反應(yīng)管中的熒光信號到達所設(shè)定的域值時所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)(threshold cycles，Ct)值。以β肌動蛋白基因為內(nèi)參，采用雙ΔCt法計算目的基因表達量，每個樣品目的基因表達量除以內(nèi)參基因β肌動蛋白表達量即為樣品基因相對含量［8］。以2－(實驗組ΔCt－對照組ΔCt)表示實驗組目的基因相對于正常對照組表達的變化倍數(shù)。其中實驗組ΔCt和對照組ΔCt分別是實驗組和對照組目的基因與內(nèi)參基因β肌動蛋白的Ct的差值。

表1 過氧化物氧還蛋白(Prx)Ⅰ，PrxⅡ，PrxⅢ，PrxⅣ及β肌動蛋白引物序列Tab.1 Primer of peroxiredoxin(Prx)Ⅰ，PrxⅡ，PrxⅢ，PrxⅣand β-actin in real time PCR

1.8 Western印跡法檢測PrxⅢ蛋白的表達

各實驗組細胞用Trizol抽提RNA的同時抽提總蛋白，用Bradford法定量蛋白，調(diào)整總蛋白上樣量，以β肌動蛋白為內(nèi)參照。SDS-PAGE電泳后，0.1 A恒流轉(zhuǎn)膜35 min;5%脫脂牛奶封閉1 h，一抗4℃孵育過夜，TBST洗膜3次，每次10 min，二抗常溫孵育1 h，TBST洗膜3次，每次10 min，在暗房進行化學(xué)發(fā)光試劑染膜后顯影成像。以目標條帶與β肌動蛋白條帶積分吸光度(integrated absorbance，IA)的比值定量蛋白表達。

1.9 統(tǒng)計學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 氫醌對HL-60細胞形態(tài)的影響

圖1染色結(jié)果顯示，正常對照組細胞胞體較大，胞核大而圓，胞質(zhì)堿深染，核質(zhì)比例大。DMSO，HQ+DMSO組可見細胞胞體明顯縮小，胞核凹陷，核質(zhì)比例縮小，桿狀核、分葉核細胞增多，細胞趨于向成熟粒系分化。PMA和HQ+PMA組可見部分細胞易貼壁，細胞核漿比例變小，核形狀不規(guī)則，有明顯的扭曲或折疊，呈腎形或U形、馬蹄形等，呈現(xiàn)向單核或巨噬細胞分化的特征。

圖1 氫醌(HQ)對HL-60細胞形態(tài)的影響 (瑞氏-姬姆薩染色 ×400).A:正常對照細胞，箭頭示細胞胞核大而圓;B:豆蔻酰佛波醇乙酯(phorbol 12-myristate 13-acetate，PMA)處理細胞48 h后，箭頭示U形細胞;C:1.25%二甲亞砜(DMSO)處理細胞96 h后，箭頭示多葉核細胞;D:PMA+HQ 50 μmol·L－1處理細胞48 h后，箭頭示不規(guī)則核細胞;E:DMSO+HQ 5 μmol·L－1處理細胞96 h后，箭頭示細胞胞核凹陷;F:DMSO+HQ 50 μmol·L－1處理細胞96 h后，箭頭示多葉核細胞.Fig.1 Effect of hydroquinone(HQ)on morphological changes in HL-60 cells(Wright Giemsa ×400).

2.2 氫醌對HL-60細胞分化的影響

表2所示各實驗組的HL-60細胞對NBT還原力。與正常對照組比較，PMA組和DMSO組HL-60細胞NBT還原力明顯增加(P＜0.05)，說明PMA和DMSO可分別誘導(dǎo)HL-60細胞向單核細胞和粒細胞分化。與PMA和DMSO對照組比較，PMA+HQ和DMSO+HQ各組細胞對NBT還原力均下降，PMA+HQ 5 和 50 μmol·L－1組與 PMA 組比較有明顯差異(P ＜0.05)，說明 HQ 1 和5 μmol·L－1可以抑制 HL-60 細胞向單核系分化;DMSO+HQ 50 μmol·L－1組和DMSO對照組比較有顯著差異(P＜0.05)，表明HQ 50 μmol·L－1可抑制細胞向粒系分化。

表2 氫醌對HL-60細胞分化的影響Tab.2 Effect of HQ on differentiation of HL-60 cells

2.3 氫醌對HL-60細胞增殖的影響

如表 3 所示，HQ 50 μmol·L－1+PMA 作用于HL-60細胞后，細胞CCK-8還原值與單獨PMA組比較明顯下降;HQ 5，50 μmol·L－1+DMSO 組細胞CCK-8的還原值與單獨DMSO組比較明顯下降。這表明 HQ 5 和 50 μmol·L－1與誘導(dǎo)劑的共同作用可以抑制HL-60細胞增殖。

表3 氫醌對HL-60細胞增殖的影響Tab.3 Effect of HQ on proliferation of HL-60 cells

2.4 氫醌對HL-60細胞2-Cys Prxs基因表達的影響

總RNA凝膠電泳后，28 s亮度明顯強于18 s，5 s很弱，說明RNA完整性較好(圖2)，分光光度計測A260/A280在1.8～2.1。各目的基因在 HL-60 細胞表達相對定量檢測結(jié)果顯示，PrxⅠ～PrxⅣ各引物融解曲線均呈清晰的單一峰型，說明設(shè)計的引物擴增出的擴增產(chǎn)物沒有非特異性擴增，引物可用。各基因表達Ct值在16～24，各基因的相對表達量在0.15～2。與正常對照組比較，PMA組2-Cys Prxs基因表達水平均有降低的趨勢，PrxⅢ的表達水平與正常對照組比較有明顯差異(P＜0.05);DMSO組的2-Cys Prxs基因表達水平顯著降低(P＜0.01)。給予 HQ 刺激后，在PMA+HQ 5 μmol·L－1組，PrxⅢ，PrxⅣ的表達高于對照組(P＜0.01)，在PMA+HQ 50 μmol·L－1組，PrxⅠ，PrxⅢ，PrxⅣ的表達水平與正常對照組和PMA組相比明顯增高(P＜0.01)。PrxⅡ在各處理組的表達水平低于對照組，但沒有統(tǒng)計學(xué)意義。而隨著 HQ 濃度的增加，只有 HQ 50 μmol·L－1+DMSO組PrxⅠ，PrxⅢ的表達水平與DMSO組相比明顯增高(P ＜0.01)，HQ 5 μmol·L－1+1.25%DMSO各組與單獨DMSO組比較，2-Cys Prxs各基因表達水平的差別沒有統(tǒng)計學(xué)意義(表4，表5)。

圖2HQ作用HL-60細胞后的核蛋白體RNA瓊脂糖凝膠電泳圖.M:標志物;條帶1～5:分別為正常對照，PMA，PMA+HQ1，5 和50 μmol·L－1組.Fig.2 RNA agarose gel electrophoresis of HL-60 cells affected by HQ.

表4 HQ對PMA誘導(dǎo)的HL-60細胞向單核系分化過程中過氧化物酶2-Cys過氧化物氧還蛋白(2-Cys Prx)基因表達的影響Tab.4 Effect of HQ on expression of 2-Cys peroxiredoxins(2-Cys Prxs)in HL-60 cells during monocytic differentiation induced by PMA

表5 HQ對DMSO誘導(dǎo)的HL-60細胞向粒系分化過程中2-Cys Prxs基因表達的影響Tab.5 Effect of HQ on expression of 2-Cys Prxs in HL-60 cells during granulocytes differentiation induced by DMSO

2.5 氫醌對HL-60細胞PrxⅢ蛋白表達的影響

如圖3和圖4所示，PMA對照組和DMSO對照組PrxⅢ蛋白表達水平均低于正常對照組。在PMA誘導(dǎo)分化的實驗組中，給予HQ共同處理后，各組PrxⅢ蛋白表達量有顯著增加的趨勢(P＜0.01)。在DMSO誘導(dǎo)分化的實驗組中，只有在HQ 50 μmol·L－1+DMSO組PrxⅢ表達量明顯高于DMSO對照組(P＜0.01)但低于正常對照組(P＜0.05)。蛋白免疫印跡結(jié)果與熒光定量PCR結(jié)果是一致的，說明PrxⅢmRNA表達水平變化和蛋白表達水平的變化是一致的。

圖3HQ對PMA誘導(dǎo)的HL-60細胞向單核系分化過程中PrxⅢ蛋白表達的影響.A:Western印跡;B:半定量結(jié)果.1～5分別為正常對照，PMA對照，PMA+HQ 1，5和50 μmol·L－1組.±s，n=6.*P＜0.05，與正常對照組比較;##P＜0.01，與PMA對照組比較.Fig.3 Effect of HQ on expression of PrxⅢ protein in HL-60 cells during monocytic differentiation induced by PMA detected by Western blotting.

圖4HQ對1.25%DMSO誘導(dǎo)的HL-60細胞向粒系分化過程中PrxⅢ蛋白表達的影響.A:Western印跡;B:半定量結(jié)果.1～5分別為正常對照，DMSO對照，DMSO+HQ 1，5和50 μmol·L－1組.±s，n=6.*P＜0.05，與正常對照組比較;##P＜0.01，與DMSO組比較.Fig.4 Effect of HQ on expression of PrxⅢ protein in HL-60 cells during grannlocytes differentiation induced by 1.25%DMSO detected by Western blotting.

3 討論

本研究結(jié)果顯示，HQ作用后，PMA誘導(dǎo)HL-60細胞向單核系分化受到抑制，與Oliveira等［7］所報道的一致。但關(guān)于HQ對HL-60細胞向粒系分化的影響，Oliverira［7］與 Hedli等［9］報道不一，可能是由于HQ劑量不同所致。而在本實驗中，HQ 1 μmol·L－1對粒系分化無影響，但較高劑量HQ可抑制細胞向粒系分化，這些結(jié)果提示細胞向單核系分化較向粒系分化對HQ所引起的細胞毒性作用更為敏感。在本實驗中也發(fā)現(xiàn)，較高劑量HQ抑制分化的同時伴隨細胞增殖的抑制，說明一定劑量HQ可以影響細胞的分化與增殖，它可能就是通過這種途徑而發(fā)揮其在血液系統(tǒng)中的毒性作用。

本研究結(jié)果顯示，PrxⅠ，PrxⅢ和PrxⅣ與HQ對HL-60細胞分化和增殖抑制的生物學(xué)效應(yīng)有關(guān)。其中PrxⅢ在所有分化抑制的細胞組表達顯著增高，而在分化未受到抑制的組未見誘導(dǎo)表達，提示其在HQ抑制分化過程中扮演重要角色。但在本次實驗中，未能用RNAi技術(shù)抑制PrxⅢmRNA表達來進一步觀察PrxⅢ是否真正地參與HQ抑制HL-60細胞分化的過程，因此還不能說明PrxⅢ與此過程有真正的因果關(guān)系，這在后續(xù)的實驗中會繼續(xù)研究。PRXⅢ定位于線粒體，在線粒體抗氧化防御機制中起著重要作用，并且參與細胞的增殖、分化、轉(zhuǎn)化和凋亡等活動［10－11］。Yang 等［10］研究表明 PrxⅢ與紅細胞的分化有關(guān)，Wonsey等［11］也發(fā)現(xiàn)PrxⅢ是Myc的靶基因，參與Myc介導(dǎo)的增殖、凋亡和腫瘤轉(zhuǎn)化。但PrxⅢ在粒系分化中的作用如何尚未見報道，其在HQ對HL-60細胞分化影響過程中的具體作用及機制如何，其表達水平的變化是分化的原因還是結(jié)果等問題都還有待進一步研究。

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