韋瀟湘，唐 深，王春雙，陳長(zhǎng)艷，陸彩玲，郭松超，李習(xí)藝

(廣西醫(yī)科大學(xué)1.公共衛(wèi)生學(xué)院;2.基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院;廣西南寧 530021)

氫醌(hydroquinone，HQ)又名對(duì)苯二酚［C6H(OH)］，是苯在生物體內(nèi)的代謝產(chǎn)物，在苯血液毒性中發(fā)揮重要的作用，可導(dǎo)致再生障礙性貧血、骨髓異常增生綜合征、白血病及淋巴瘤等多種造血系統(tǒng)功能障礙，研究HQ血液毒性機(jī)制對(duì)探討苯的毒性機(jī)制具有重要的意義。前期研究發(fā)現(xiàn)，在人胚肺成纖維細(xì)胞MRC-5及人臍血單個(gè)核細(xì)胞中，HQ的毒性可能與過(guò)氧化物酶2-Cys過(guò)氧化物氧還蛋白(peroxiredoxins)(2-Cys Prxs)有關(guān)［1－2］。2-Cys Prxs是細(xì)胞內(nèi)一類抗氧化蛋白家族，它們都有兩個(gè)高度保守的具有氧化還原活性的半胱氨酸殘基，即過(guò)氧化活性的胱氨酸殘基cys51和還原活性的半胱氨酸殘基cys172。2-Cys Prxs在氧化應(yīng)激中發(fā)揮重要的作用［3］，保護(hù)細(xì)胞免受氧自由基損害，同時(shí)它們?cè)诩?xì)胞增殖與分化中也起著重要的作用［4］。HL-60細(xì)胞株是人前髓細(xì)胞株，其髓系祖細(xì)胞特性明顯，具有多向分化能力，在豆蔻酰佛波醇(phorbol 12-myristate 13-acetate，PMA)或二甲亞砜(DMSO)誘導(dǎo)下可分別向單核系或粒系分化，適用于粒系、單核系分化研究［5－6］。本實(shí)驗(yàn)主要研究HQ對(duì)HL-60細(xì)胞向單核系、粒系分化的影響，并探討2-Cys Prxs在其中的作用。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞與試劑

HL-60細(xì)胞購(gòu)自上海細(xì)胞生物所，IMDM培養(yǎng)基購(gòu)自美國(guó)海克隆實(shí)驗(yàn)室公司，PMA和HQ購(gòu)自Sigma公司，硝基四氮唑藍(lán)(NBT)購(gòu)自Sanland公司，Cell Counting Kit-8(CCK-8試劑盒)、顯影定影試劑盒購(gòu)自碧云天生物技術(shù)研究所。cDNA合成試劑盒、PCR試劑盒與熒光定量 PCR引物購(gòu)自沈陽(yáng)TaKaRa公司;Trizol購(gòu)自美國(guó) Invitrogen公司，Western印跡抗體購(gòu)自Santa Cruz公司及Fermantas公司，其余試劑為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)

HL-60細(xì)胞培養(yǎng)于IMDM培養(yǎng)基，含胎牛血淸200 ml·L－1，青霉素 100 kU·L－1，鏈霉素 100 mg·L－1。在37℃，含體積分?jǐn)?shù)為0.05 CO2的培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)傳代。

1.3 HL-60 細(xì)胞染毒

根據(jù)前期實(shí)驗(yàn)結(jié)果及文獻(xiàn)［2，5－6］，細(xì)胞分為正常對(duì)照組、PMA 20 nmol·L－1、PMA 20 nmol·L－1+HQ 1，5 和50 μmol·L－1，以及 1.25%DMSO對(duì)照、DMSO+HQ 1，5 和 50 μmol·L－1組，各組細(xì)胞數(shù)為1×109L－1。HQ用前用無(wú)血清IMDM配制，正常對(duì)照組加入相應(yīng)體積無(wú)血清IMDM。分別在48和96 h收集細(xì)胞。

1.4 細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察

取各個(gè)實(shí)驗(yàn)組的HL-60細(xì)胞懸液5 μl推片晾干，乙醇 50 ml·L－1固定 5 min，乙醇 80 ml·L－1固定5 min后晾干，瑞氏-姬姆薩染液染色5～10 min沖洗晾干，光鏡下觀察。

1.5 NBT還原酶檢測(cè)HL-60細(xì)胞分化

收集各個(gè)實(shí)驗(yàn)組的HL-60細(xì)胞，錐蟲(臺(tái)盼)藍(lán)檢測(cè)細(xì)胞活力，取200 μl含有1×1 O5個(gè)活細(xì)胞的細(xì)胞懸液，加入200 μl 1%NBT 溶液含終濃度為2 mg·L－1的佛波酯(PMA)混合，放入37℃孵育60 min，再將細(xì)胞離心后去除上清液，每份標(biāo)本加入200 μl DMSO，在室溫下振蕩20 min，測(cè)波長(zhǎng)570 nm的吸光度值(absorbance，A)［7－8］。A 值越大表明細(xì)胞分化程度越佳。

1.6 HL-60細(xì)胞增殖檢測(cè)

參照CCK-8試劑說(shuō)明書收集各組HL-60細(xì)胞，棄原培養(yǎng)液，每組細(xì)胞加入含 CCK-8 100 ml·L－1的培養(yǎng)基，37℃繼續(xù)培養(yǎng)1 h后，測(cè)定A450nm。

1.7 熒光定量PCR檢測(cè)2-Cys Prxs基因表達(dá)

1.7.1 總 RNA 制備

離心收集各實(shí)驗(yàn)組的細(xì)胞，棄培養(yǎng)液，加入1 ml Trizol，室溫放置 10 min，加 0.2 ml氯仿，振蕩 15 s，靜置3 min，4℃，12 000×g離心15 min，取水相加入0.5 ml異丙醇，室溫放置10 min，4℃，12 000 ×g離心10 min，75%乙醇洗滌干燥后溶于純焦碳酸二乙酯，紫外分光光度儀檢測(cè)提取總RNA的質(zhì)量和濃度。要求A260/A280在1.8～2.1范圍，并計(jì)算 RNA含量。

1.7.2 cDNA 的合成

反應(yīng)體系 20 μl，取隨機(jī)引物(100 μmol·L－1)1 μl，每一份標(biāo)本取總 RNA 1 μg，RNA 酶抑制劑(40 kU·L－1)0.5 μl，dNTP 混合物 (各 10 μmol·L－1)1 μl，5 倍反應(yīng)緩沖液4 μl，逆轉(zhuǎn)錄酶100 U，加純焦碳酸二乙酯至 20 μl。按 42℃ 30 min，95℃ 2 min，進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄。合成好的cDNA置于－20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.7.3 實(shí)時(shí)熒光定量 PCR檢測(cè)2-Cys Prxs基因表達(dá)

20 μl反應(yīng)體系中包括:上下游引物 10 μmol·L－1各 0.8 μl，SYBR ? Premix Ex TaqTM(2 × )10 μl，ROX Reference DyeⅡ(50 × )0.4 μl，雙蒸水 7 μl，cDNA標(biāo)本1 μl。各基因擴(kuò)增片段長(zhǎng)度如下:PrxⅠ為141 bp，PrxⅡ?yàn)?29 bp，PrxⅢ為98bp，PrxⅣ為75 bp，引物序列見(jiàn)表 1。按 95℃，30 s;40個(gè)循環(huán)(95℃，5 s;60℃，34 s)進(jìn)行反應(yīng)，反應(yīng)結(jié)束后，儀器自動(dòng)記錄每個(gè)反應(yīng)管中的熒光信號(hào)到達(dá)所設(shè)定的域值時(shí)所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)(threshold cycles，Ct)值。以β肌動(dòng)蛋白基因?yàn)閮?nèi)參，采用雙ΔCt法計(jì)算目的基因表達(dá)量，每個(gè)樣品目的基因表達(dá)量除以內(nèi)參基因β肌動(dòng)蛋白表達(dá)量即為樣品基因相對(duì)含量［8］。以2－(實(shí)驗(yàn)組ΔCt－對(duì)照組ΔCt)表示實(shí)驗(yàn)組目的基因相對(duì)于正常對(duì)照組表達(dá)的變化倍數(shù)。其中實(shí)驗(yàn)組ΔCt和對(duì)照組ΔCt分別是實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組目的基因與內(nèi)參基因β肌動(dòng)蛋白的Ct的差值。

表1 過(guò)氧化物氧還蛋白(Prx)Ⅰ，PrxⅡ，PrxⅢ，PrxⅣ及β肌動(dòng)蛋白引物序列Tab.1 Primer of peroxiredoxin(Prx)Ⅰ，PrxⅡ，PrxⅢ，PrxⅣand β-actin in real time PCR

1.8 Western印跡法檢測(cè)PrxⅢ蛋白的表達(dá)

各實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞用Trizol抽提RNA的同時(shí)抽提總蛋白，用Bradford法定量蛋白，調(diào)整總蛋白上樣量，以β肌動(dòng)蛋白為內(nèi)參照。SDS-PAGE電泳后，0.1 A恒流轉(zhuǎn)膜35 min;5%脫脂牛奶封閉1 h，一抗4℃孵育過(guò)夜，TBST洗膜3次，每次10 min，二抗常溫孵育1 h，TBST洗膜3次，每次10 min，在暗房進(jìn)行化學(xué)發(fā)光試劑染膜后顯影成像。以目標(biāo)條帶與β肌動(dòng)蛋白條帶積分吸光度(integrated absorbance，IA)的比值定量蛋白表達(dá)。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 氫醌對(duì)HL-60細(xì)胞形態(tài)的影響

圖1染色結(jié)果顯示，正常對(duì)照組細(xì)胞胞體較大，胞核大而圓，胞質(zhì)堿深染，核質(zhì)比例大。DMSO，HQ+DMSO組可見(jiàn)細(xì)胞胞體明顯縮小，胞核凹陷，核質(zhì)比例縮小，桿狀核、分葉核細(xì)胞增多，細(xì)胞趨于向成熟粒系分化。PMA和HQ+PMA組可見(jiàn)部分細(xì)胞易貼壁，細(xì)胞核漿比例變小，核形狀不規(guī)則，有明顯的扭曲或折疊，呈腎形或U形、馬蹄形等，呈現(xiàn)向單核或巨噬細(xì)胞分化的特征。

圖1 氫醌(HQ)對(duì)HL-60細(xì)胞形態(tài)的影響 (瑞氏-姬姆薩染色 ×400).A:正常對(duì)照細(xì)胞，箭頭示細(xì)胞胞核大而圓;B:豆蔻酰佛波醇乙酯(phorbol 12-myristate 13-acetate，PMA)處理細(xì)胞48 h后，箭頭示U形細(xì)胞;C:1.25%二甲亞砜(DMSO)處理細(xì)胞96 h后，箭頭示多葉核細(xì)胞;D:PMA+HQ 50 μmol·L－1處理細(xì)胞48 h后，箭頭示不規(guī)則核細(xì)胞;E:DMSO+HQ 5 μmol·L－1處理細(xì)胞96 h后，箭頭示細(xì)胞胞核凹陷;F:DMSO+HQ 50 μmol·L－1處理細(xì)胞96 h后，箭頭示多葉核細(xì)胞.Fig.1 Effect of hydroquinone(HQ)on morphological changes in HL-60 cells(Wright Giemsa ×400).

2.2 氫醌對(duì)HL-60細(xì)胞分化的影響

表2所示各實(shí)驗(yàn)組的HL-60細(xì)胞對(duì)NBT還原力。與正常對(duì)照組比較，PMA組和DMSO組HL-60細(xì)胞NBT還原力明顯增加(P＜0.05)，說(shuō)明PMA和DMSO可分別誘導(dǎo)HL-60細(xì)胞向單核細(xì)胞和粒細(xì)胞分化。與PMA和DMSO對(duì)照組比較，PMA+HQ和DMSO+HQ各組細(xì)胞對(duì)NBT還原力均下降，PMA+HQ 5 和 50 μmol·L－1組與 PMA 組比較有明顯差異(P ＜0.05)，說(shuō)明 HQ 1 和5 μmol·L－1可以抑制 HL-60 細(xì)胞向單核系分化;DMSO+HQ 50 μmol·L－1組和DMSO對(duì)照組比較有顯著差異(P＜0.05)，表明HQ 50 μmol·L－1可抑制細(xì)胞向粒系分化。

表2 氫醌對(duì)HL-60細(xì)胞分化的影響Tab.2 Effect of HQ on differentiation of HL-60 cells

2.3 氫醌對(duì)HL-60細(xì)胞增殖的影響

如表 3 所示，HQ 50 μmol·L－1+PMA 作用于HL-60細(xì)胞后，細(xì)胞CCK-8還原值與單獨(dú)PMA組比較明顯下降;HQ 5，50 μmol·L－1+DMSO 組細(xì)胞CCK-8的還原值與單獨(dú)DMSO組比較明顯下降。這表明 HQ 5 和 50 μmol·L－1與誘導(dǎo)劑的共同作用可以抑制HL-60細(xì)胞增殖。

表3 氫醌對(duì)HL-60細(xì)胞增殖的影響Tab.3 Effect of HQ on proliferation of HL-60 cells

2.4 氫醌對(duì)HL-60細(xì)胞2-Cys Prxs基因表達(dá)的影響

總RNA凝膠電泳后，28 s亮度明顯強(qiáng)于18 s，5 s很弱，說(shuō)明RNA完整性較好(圖2)，分光光度計(jì)測(cè)A260/A280在1.8～2.1。各目的基因在 HL-60 細(xì)胞表達(dá)相對(duì)定量檢測(cè)結(jié)果顯示，PrxⅠ～PrxⅣ各引物融解曲線均呈清晰的單一峰型，說(shuō)明設(shè)計(jì)的引物擴(kuò)增出的擴(kuò)增產(chǎn)物沒(méi)有非特異性擴(kuò)增，引物可用。各基因表達(dá)Ct值在16～24，各基因的相對(duì)表達(dá)量在0.15～2。與正常對(duì)照組比較，PMA組2-Cys Prxs基因表達(dá)水平均有降低的趨勢(shì)，PrxⅢ的表達(dá)水平與正常對(duì)照組比較有明顯差異(P＜0.05);DMSO組的2-Cys Prxs基因表達(dá)水平顯著降低(P＜0.01)。給予 HQ 刺激后，在PMA+HQ 5 μmol·L－1組，PrxⅢ，PrxⅣ的表達(dá)高于對(duì)照組(P＜0.01)，在PMA+HQ 50 μmol·L－1組，PrxⅠ，PrxⅢ，PrxⅣ的表達(dá)水平與正常對(duì)照組和PMA組相比明顯增高(P＜0.01)。PrxⅡ在各處理組的表達(dá)水平低于對(duì)照組，但沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。而隨著 HQ 濃度的增加，只有 HQ 50 μmol·L－1+DMSO組PrxⅠ，PrxⅢ的表達(dá)水平與DMSO組相比明顯增高(P ＜0.01)，HQ 5 μmol·L－1+1.25%DMSO各組與單獨(dú)DMSO組比較，2-Cys Prxs各基因表達(dá)水平的差別沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(表4，表5)。

圖2HQ作用HL-60細(xì)胞后的核蛋白體RNA瓊脂糖凝膠電泳圖.M:標(biāo)志物;條帶1～5:分別為正常對(duì)照，PMA，PMA+HQ1，5 和50 μmol·L－1組.Fig.2 RNA agarose gel electrophoresis of HL-60 cells affected by HQ.

表4 HQ對(duì)PMA誘導(dǎo)的HL-60細(xì)胞向單核系分化過(guò)程中過(guò)氧化物酶2-Cys過(guò)氧化物氧還蛋白(2-Cys Prx)基因表達(dá)的影響Tab.4 Effect of HQ on expression of 2-Cys peroxiredoxins(2-Cys Prxs)in HL-60 cells during monocytic differentiation induced by PMA

表5 HQ對(duì)DMSO誘導(dǎo)的HL-60細(xì)胞向粒系分化過(guò)程中2-Cys Prxs基因表達(dá)的影響Tab.5 Effect of HQ on expression of 2-Cys Prxs in HL-60 cells during granulocytes differentiation induced by DMSO

2.5 氫醌對(duì)HL-60細(xì)胞PrxⅢ蛋白表達(dá)的影響

如圖3和圖4所示，PMA對(duì)照組和DMSO對(duì)照組PrxⅢ蛋白表達(dá)水平均低于正常對(duì)照組。在PMA誘導(dǎo)分化的實(shí)驗(yàn)組中，給予HQ共同處理后，各組PrxⅢ蛋白表達(dá)量有顯著增加的趨勢(shì)(P＜0.01)。在DMSO誘導(dǎo)分化的實(shí)驗(yàn)組中，只有在HQ 50 μmol·L－1+DMSO組PrxⅢ表達(dá)量明顯高于DMSO對(duì)照組(P＜0.01)但低于正常對(duì)照組(P＜0.05)。蛋白免疫印跡結(jié)果與熒光定量PCR結(jié)果是一致的，說(shuō)明PrxⅢmRNA表達(dá)水平變化和蛋白表達(dá)水平的變化是一致的。

圖3HQ對(duì)PMA誘導(dǎo)的HL-60細(xì)胞向單核系分化過(guò)程中PrxⅢ蛋白表達(dá)的影響.A:Western印跡;B:半定量結(jié)果.1～5分別為正常對(duì)照，PMA對(duì)照，PMA+HQ 1，5和50 μmol·L－1組.±s，n=6.*P＜0.05，與正常對(duì)照組比較;##P＜0.01，與PMA對(duì)照組比較.Fig.3 Effect of HQ on expression of PrxⅢ protein in HL-60 cells during monocytic differentiation induced by PMA detected by Western blotting.

圖4HQ對(duì)1.25%DMSO誘導(dǎo)的HL-60細(xì)胞向粒系分化過(guò)程中PrxⅢ蛋白表達(dá)的影響.A:Western印跡;B:半定量結(jié)果.1～5分別為正常對(duì)照，DMSO對(duì)照，DMSO+HQ 1，5和50 μmol·L－1組.±s，n=6.*P＜0.05，與正常對(duì)照組比較;##P＜0.01，與DMSO組比較.Fig.4 Effect of HQ on expression of PrxⅢ protein in HL-60 cells during grannlocytes differentiation induced by 1.25%DMSO detected by Western blotting.

3 討論

本研究結(jié)果顯示，HQ作用后，PMA誘導(dǎo)HL-60細(xì)胞向單核系分化受到抑制，與Oliveira等［7］所報(bào)道的一致。但關(guān)于HQ對(duì)HL-60細(xì)胞向粒系分化的影響，Oliverira［7］與 Hedli等［9］報(bào)道不一，可能是由于HQ劑量不同所致。而在本實(shí)驗(yàn)中，HQ 1 μmol·L－1對(duì)粒系分化無(wú)影響，但較高劑量HQ可抑制細(xì)胞向粒系分化，這些結(jié)果提示細(xì)胞向單核系分化較向粒系分化對(duì)HQ所引起的細(xì)胞毒性作用更為敏感。在本實(shí)驗(yàn)中也發(fā)現(xiàn)，較高劑量HQ抑制分化的同時(shí)伴隨細(xì)胞增殖的抑制，說(shuō)明一定劑量HQ可以影響細(xì)胞的分化與增殖，它可能就是通過(guò)這種途徑而發(fā)揮其在血液系統(tǒng)中的毒性作用。

本研究結(jié)果顯示，PrxⅠ，PrxⅢ和PrxⅣ與HQ對(duì)HL-60細(xì)胞分化和增殖抑制的生物學(xué)效應(yīng)有關(guān)。其中PrxⅢ在所有分化抑制的細(xì)胞組表達(dá)顯著增高，而在分化未受到抑制的組未見(jiàn)誘導(dǎo)表達(dá)，提示其在HQ抑制分化過(guò)程中扮演重要角色。但在本次實(shí)驗(yàn)中，未能用RNAi技術(shù)抑制PrxⅢmRNA表達(dá)來(lái)進(jìn)一步觀察PrxⅢ是否真正地參與HQ抑制HL-60細(xì)胞分化的過(guò)程，因此還不能說(shuō)明PrxⅢ與此過(guò)程有真正的因果關(guān)系，這在后續(xù)的實(shí)驗(yàn)中會(huì)繼續(xù)研究。PRXⅢ定位于線粒體，在線粒體抗氧化防御機(jī)制中起著重要作用，并且參與細(xì)胞的增殖、分化、轉(zhuǎn)化和凋亡等活動(dòng)［10－11］。Yang 等［10］研究表明 PrxⅢ與紅細(xì)胞的分化有關(guān)，Wonsey等［11］也發(fā)現(xiàn)PrxⅢ是Myc的靶基因，參與Myc介導(dǎo)的增殖、凋亡和腫瘤轉(zhuǎn)化。但PrxⅢ在粒系分化中的作用如何尚未見(jiàn)報(bào)道，其在HQ對(duì)HL-60細(xì)胞分化影響過(guò)程中的具體作用及機(jī)制如何，其表達(dá)水平的變化是分化的原因還是結(jié)果等問(wèn)題都還有待進(jìn)一步研究。

［1］ Li X，Tang S，Huang H，Yang L，Liu J，Zhuang Z.Induction of a cell-survival adaptive response in MRC-5 cells by hydroquinone［J］.Mutat Res，2008，652(2):180-185.

［2］ 唐 深，李習(xí)藝，陸彩玲，曾曉春，肖德強(qiáng)，孫 斌，等.氫醌刺激臍血單個(gè)核細(xì)胞適應(yīng)性反應(yīng)基因表達(dá)［J］.中國(guó)公共衛(wèi)生，2009，25(11):1339-1340.

［3］ Fujii J，Ikeda Y.Advances in our understanding of peroxiredoxin，a multifunctional，mammalian redox protein［J］.Redox Rep，2002，7(3):123-130.

［4］ Butterfield LH，Merino A，Golub SH，Shau H.From cytoprotection to tumor suppression:the multifactorial role of peroxiredoxins［J］.Antioxid Redox Signal，1999，1(4):385-402.

［5］ Zheng X，Ravatn R，Lin Y，Shih WC，Rabson A，Strair R，et al.Gene expression of TPA induced differentiation in HL-60 cells by DNA microarray analysis［J］.Nucleic Acids Res，2002，30(20):4489-4499.

［6］ Saegusa S，Totsuka M，Kaminogawa S，Hosoi T.Saccharomyces cerevisiae and Candida albicans stimulate cytokine secretion from human neutrophil-like HL-60 cells differentiated with retinoic acid or dimethylsulfoxide［J］.Biosci Biotechnol Biochem，2009，73(12):2600-2608.

［7］ Oliveira NL，Kalf GF.Induced differentiation of HL-60 promyelocytic leukemia cells to monocyte/macrophages is inhibited by hydroquinone，a hematotoxic metabolite of benzene［J］.Blood，1992，79(3):627-633.

［8］ Li D，Wang Z，Chen H，Wang J，Zheng Q，Shang J，et al.Isoliquiritigenin induces monocytic differentiation of HL-60 cells［J］.Free Radic Biol Med，2009，46(6):731-736.

［9］ Hedli CC，Rao NR，Reuhl KR，Witmer CM，Snyder R.Effects of benzene metabolite treatment on granulocytic differentiation and DNA adduct formation in HL-60 cells［J］.Arch Toxicol，1996，70(3-4):135-144.

［10］ Yang HY， Jeong DK， Kim SH， Chung KJ，Cho EJ，Yang U，et al.The role of peroxiredoxinⅢ on late stage of proerythrocyte differentiation［J］.Biochem Biophys Res Commun，2007，359(4):1030-1036.

［11］ Wonsey DR， Zeller KI， Dang CV. The c-Myc target gene PRDX3 is required for mitochondrial homeostasis and neoplastic transformation［J］.Proc Natl Acad Sci USA，2002，99(10):6649-6654.