陳 放，劉開揚，徐 珊，李偉紅，李國立，張洪泉

(揚州大學(xué)1.臨床醫(yī)學(xué)院眼科，2.醫(yī)藥研究所，江蘇揚州 225001)

糖尿病性視網(wǎng)膜病變(diabetic retinopathy，DR)是糖尿病(diabetes mellitus，DM)嚴(yán)重且常見的微血管并發(fā)癥之一。研究發(fā)現(xiàn)，糖尿病可導(dǎo)致幾乎所有類型的視網(wǎng)膜神經(jīng)細胞發(fā)生結(jié)構(gòu)和功能的改變，神經(jīng)元的凋亡、神經(jīng)節(jié)細胞的丟失、膠質(zhì)細胞的活化、神經(jīng)微絲異常以及視神經(jīng)逆向軸漿運輸?shù)臏p慢，這一系列改變均顯示DR不僅是微血管病變，而且也是神經(jīng)元病變，有時甚至在眼底熒光血管造影等檢查尚未發(fā)現(xiàn)異常時，便出現(xiàn)視網(wǎng)膜神經(jīng)元細胞的丟失［1］。核轉(zhuǎn)錄因子-κB(NF-κB)信號通路在DR發(fā)病中起重要作用。DM時多種因素導(dǎo)致氧化應(yīng)激，激活NF-κB，啟動下游基因轉(zhuǎn)錄，上調(diào)多種與DR有關(guān)的細胞因子、炎癥因子、黏附分子的表達［2－4］。葛根素(puerarin)是從中藥豆科葛屬植物野葛〔Pueraria lobata(Willd.)Ohwi〕的根中提取的異黃酮類有效成分，化學(xué)名為8-β-D-吡喃葡萄糖-4'，7'-二羥基異黃酮苷。近幾年研究表明，葛根素具有多種藥理作用，包括降血脂、抗氧化、抑制低密度脂蛋白氧化修飾、清除活性氧自由基、調(diào)節(jié)一氧化氮合酶(NOS)活性使NO增高等［5－6］。陳娟等［7］研究發(fā)現(xiàn)，葛根素可顯著提高缺血再灌注細胞的存活率，降低胱天蛋白酶3的活性而抑制細胞凋亡，發(fā)揮神經(jīng)保護作用。遇穎等［8］從形態(tài)學(xué)上證實葛根素可改善DM大鼠的病理改變，對DR具有良好的治療效果。本文采用DM大鼠模型，通過觀察早期DM大鼠視網(wǎng)膜功能、超微結(jié)構(gòu)的變化和NF-κB的表達及葛根素的干預(yù)作用，為中醫(yī)藥防治DM并發(fā)癥提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 藥物、試劑及儀器

葛根素粉末為南京正大天晴制藥公司提供，純度99.8%，使用時用滅菌水配成混懸液;鏈脲佐菌素(streptozotocin，STZ)購自美國 Sigma公司;NF-κB 檢測試劑盒購自美國Santa Cruz公司;TUNEL檢測試劑盒購自美國Roche公司。One Touch血糖儀及血糖試紙條為美國強生公司產(chǎn)品;視覺電生理檢測儀為重慶康華公司產(chǎn)品;手術(shù)顯微鏡為蘇州六六視覺公司產(chǎn)品;H-600型透射電子顯微鏡為日本日立公司產(chǎn)品。

1.2 動物、模型的建立與分組

清潔級雄性 Sprague-Dawley(SD)大鼠50只，浙江省實驗動物中心提供，許可證號SCXK(浙)2008-0033，體質(zhì)量200～230 g。除正常對照組10只SD大鼠除外，其余各組大鼠STZ誘導(dǎo)制備糖尿病大鼠模型。造模前大鼠禁食12 h，自由飲水。將STZ用pH為4.5的枸櫞酸-枸櫞酸鈉緩沖液0.1 mmol·L－1配成 1%STZ 溶液，2 μm 過濾器過濾滅菌后，于大鼠左下腹單次ip給予STZ 60 mg·kg－1。72 h后取鼠尾血測血糖，并用尿糖試紙測尿糖。隨機血糖濃度≥16.65 mmol·L－1，尿糖 ++ ～ +++ 者即為糖尿病大鼠。同齡正常大鼠同期給予pH為4.5的枸櫞酸緩沖液 0.5 ml，48 h后測量血糖 ＜5.6 mmol·L－1確定為正常對照組。DM大鼠再隨機分為DM模型組、葛根素 125，250和 500 mg·kg－1治療組。葛根素用滅菌水制成混懸液ig給予大鼠，每日1次，連續(xù)給藥4周。

1.3 視網(wǎng)膜電圖(electroretinogram，ERG)的測定

分別于造模前及實驗結(jié)束處死前測定閃光ERG。大鼠暗適應(yīng)30 min，ip給予3%戊巴比妥鈉40 mg·kg－1麻醉后，0.5% 托吡卡胺/去氧腎上腺素散瞳，參考電極置于兩眼連線中點皮下，接地電極刺入耳尖皮下。操作時白光閃耀，反應(yīng)持續(xù)200 ms，光強度10 cd·s－1·m－2，單次反應(yīng)。記錄暗適應(yīng)眼最大反應(yīng)的b波振幅。

1.4 電子顯微鏡標(biāo)本的制作及觀察

大鼠 ip給予3%戊巴比妥鈉40 mg·kg－1麻醉后，摘除雙眼眼球。一眼球2.5%中性戊二醛溶液固定12 h以上，取水平眼球赤道后視網(wǎng)膜組織1 mm ×3 mm，PBS 1 mol·L－130 min，中間換液 2 次。放入1%的四氧化鋨緩沖液固定2 h，PBS沖洗3次，逐級乙醇脫水，環(huán)氧樹脂包埋。切1 μm的半薄切片作光鏡定位，然后做超薄切片，醋酸雙氧鈾和枸櫞酸鉛雙重染色。透射電鏡觀察視網(wǎng)膜超微結(jié)構(gòu)。

1.5 TUNEL法檢測凋亡細胞

將上述摘除的另一眼球用4%多聚甲醛溶液固定2 h，剔去角膜、晶狀體制成眼杯，固定4～6 h后取出眼杯依次梯度乙醇脫水，石蠟包埋、切片。石蠟切片常規(guī)脫蠟，乙醇梯度水化，用含2%H2O2的PBS于室溫反應(yīng)5 min，PBS沖洗5 min，切片上滴加54 μl末端核酸轉(zhuǎn)移酶緩沖液，置室溫1～5 min，于濕盒中孵育1 h，滴加54 μl過氧化物酶標(biāo)記的抗地高辛抗體，于濕盒中室溫反應(yīng)30 min。鏈霉親和素-生物素(SABC)法染色，二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色，蒸餾水沖洗4次，每次沖洗5 min，蘇木素復(fù)染、脫水、透明后封片。以光學(xué)顯微鏡下細胞核或細胞漿呈黃色或棕黃色染色為TUNEL陽性表達。每張切片隨機選取5個高倍視野，對陽性細胞進行計數(shù)，得到平均陽性細胞數(shù)，計算凋亡指數(shù)(apoptosis index，AI)。AI(%)=凋亡細胞數(shù)/細胞總數(shù)×100%。

1.6 免疫組化染色法檢測視網(wǎng)膜組織NF-κB p65活性

石蠟切片常規(guī)脫蠟，PBS 0.1 mol·L－1浸泡 5 min，抗原修復(fù)(PBS 0.1 mol·L－1預(yù)熱至 92 ～98℃，放入玻片，加熱 5 min，自然冷卻至室溫)，PBS 0.1 mol·L－1沖洗5 min，3%過氧化氫孵育10 min，消除內(nèi)源性過氧化物酶活性，10%正常山羊血清的PBS 0.1 mol·L－1pH 7.4 稀釋，封閉游離的結(jié)合位點，減少非特異性染色，室溫孵育15 min，傾去，分別滴加1∶20稀釋的NF-κB p65單克隆一抗，陰性對照組用PBS代替一抗，4℃過夜。PBS 0.1 mol·L－1沖洗 5 min，滴加生物素標(biāo)記的二抗 IgG，37℃孵育 15 min，PBS 0.1 mol·L－1沖洗5 min，滴加辣根酶標(biāo)記鏈霉卵白素工作液，37℃孵育 15 min，PBS 0.1 mol·L－1沖洗 5 min，SABC法染色，DAB顯色，自來水沖洗5 min，蘇木素復(fù)染后封片。以光學(xué)顯微鏡下細胞核呈棕黃色或棕褐色染色為NF-κB p65陽性表達細胞。NF-κB p65活性(%)=陽性細胞數(shù)/細胞總數(shù)×100%

1.7 統(tǒng)計學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 葛根素對糖尿病大鼠視網(wǎng)膜電圖的影響

造模前各組大鼠ERG的b波振幅的差異無統(tǒng)計學(xué)意義。如表1所示，與正常對照組相比，DM模型組大鼠ERG的b波振幅明顯降低(P＜0.05)，與DM模型對照組相比，葛根素250和500 mg·kg－1組顯著上升(P ＜0.05)(表1)。

表1 葛根素對糖尿病大鼠視網(wǎng)膜電圖(ERG)的b波振幅的影響Tab.1 Effect of puerarin on b wave amplitude of the electroretinogram(ERG)of diabetic mellitus(DM)rats

2.2 葛根素對糖尿病大鼠視網(wǎng)膜超微結(jié)構(gòu)的影響

在透射電鏡下可見，正常對照組視網(wǎng)膜各層結(jié)構(gòu)清晰，細胞排列整齊，細胞核和細胞器正常，未出現(xiàn)明顯的空泡樣變性(圖1A)。DM對照組視網(wǎng)膜出現(xiàn)大量的空泡變性，外節(jié)膜盤結(jié)構(gòu)模糊，排列紊亂，腫脹變性。內(nèi)、外核層細胞內(nèi)線粒體腫脹，大量空泡樣變性(圖1B)。葛根素125和250 mg·kg－1組外節(jié)膜盤間隙較DM組縮小，排列平行度好轉(zhuǎn)，內(nèi)外核層細胞線粒體空泡變性減少(圖1C，D)。葛根素150 mg·kg－1組視網(wǎng)膜超微結(jié)構(gòu)僅有少量線粒體腫脹，與正常對照組差異不大(圖1E)。DM模型組可見，神經(jīng)節(jié)細胞層線粒體腫脹，線粒體嵴丟失，細胞核皺縮，核膜不連續(xù)、斷裂(圖2B)。葛根素125和250 mg·kg－1組外節(jié)神經(jīng)節(jié)細胞線粒體空泡樣變性的比例下降，線粒體仍有腫脹(圖2C，D)。葛根素500 mg·kg－1組視網(wǎng)膜在透射電鏡下可見節(jié)細胞排列緊密，未出現(xiàn)明顯的空泡變性，線粒體腫脹明顯好轉(zhuǎn)(圖2E)。

2.3 葛根素對糖尿病大鼠視網(wǎng)膜凋亡及 NF-κB p65活性影響

如表2和圖3所示，正常對照組細胞凋亡少，偶見神經(jīng)節(jié)細胞和內(nèi)核層細胞有染色陽性細胞。與正常對照組相比，DM模型組視網(wǎng)膜細胞凋亡指數(shù)顯著增高(P＜0.05)，主要發(fā)生在神經(jīng)節(jié)細胞層和內(nèi)核層細胞。葛根素干預(yù)后各組凋亡指數(shù)均顯著下降(P＜0.05)。如表2和圖4所示，正常對照組大鼠視網(wǎng)膜組織基本無NF-κB p65蛋白陽性表達。DM模型對照組視網(wǎng)膜 NF-κB p65表達明顯增強(P＜0.05)，可見于視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞層、內(nèi)核層及外核層。葛根素干預(yù)后視網(wǎng)膜NF-κB p65表達有所下降，其中葛根素250和500 mg·kg－1組與DM模型組顯示統(tǒng)計學(xué)意義差異(P＜0.05)。

表2 葛根素對DM大鼠視網(wǎng)膜組織細胞凋亡指數(shù)及NF-κB p65活性影響Tab.2 Effect of puerarin on NF-κB activity and apoptoic index in the rat retina

圖1 葛根素對糖尿病(DM)大鼠視網(wǎng)膜超微結(jié)構(gòu)的影響 (×9700).動物分組及給藥方法見表1.動物給藥4周后取視網(wǎng)膜組織切片檢查.A:正常對照組;B:模型組;C－E:葛根素125，250和500 mg·kg－1組.Fig.1 Effect of puerarin on retinal ultrastructure of rats(×9700)

圖2 葛根素對糖尿病(DM)大鼠視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞層的影響.動物分組及給藥見表1.A:正常對照組;B:模型組;C－E:葛根素125，250和500 mg·kg－1組.Fig.2 Effect of puerarin on the retinal ganglion cell layer in DM rats.

圖3 葛根素對DM大鼠視網(wǎng)膜細胞凋亡的影響 (DAB×400).動物分組及給藥見圖1.A:正常對照組;B:模型組;C－E:葛根素125，250和500 mg·kg－1組.黃色或棕黃色為陽性細胞.Fig.3 Effect of puerarin on retinal apoptosis in DM rats by TUNEL(DAB ×400).

圖4 葛根素對DM大鼠視網(wǎng)膜組織NF-κB p65活性的影響 (DAB×400).動物分組及給藥見表1.A:正常對照組;B:模型組;C－E:葛根素125，250和500 mg·kg－1組.棕黃色或棕褐色為陽性細胞.Fig.4 Effect of puerarin on retinal NF-κB p65 activity in DM rats(DAB ×400).

3 討論

本研究通過對 DM大鼠 ERG、透射電鏡及TUNEL觀察發(fā)現(xiàn)DM大鼠出現(xiàn)神經(jīng)視網(wǎng)膜的改變。b波起源于外層視網(wǎng)膜，比較穩(wěn)定，主要反映視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞以前的視網(wǎng)膜神經(jīng)細胞的功能狀態(tài)。Li等［9］報道STZ誘導(dǎo)的DM大鼠成模后2周就可發(fā)生b波的振幅下降，而DM大鼠模型至少3個月左右才出現(xiàn)血管改變。本研究中成模后4周的DM大鼠b波振幅較正常對照組已有顯著下降，說明DM早期視網(wǎng)膜就發(fā)生了神經(jīng)細胞功能損害。動物實驗表明，發(fā)生DM 1個月時電鏡可觀察到視網(wǎng)膜神經(jīng)元的超微結(jié)構(gòu)出現(xiàn)病理學(xué)變化，包括線粒體腫脹，線粒體嵴丟失，胞漿空泡化、核膜不完整、核破碎等，而視網(wǎng)膜微血管的基底膜和內(nèi)皮細胞未出現(xiàn)明顯異常改變［10］。本研究中透射電鏡的觀察結(jié)果亦顯示造模4周的DM大鼠神經(jīng)節(jié)細胞，內(nèi)、外核層細胞已出現(xiàn)明顯的改變，而毛細血管的改變則不明顯。TUNEL法發(fā)現(xiàn)在早期DM大鼠的視網(wǎng)膜就已發(fā)生凋亡，神經(jīng)節(jié)細胞層凋亡細胞的數(shù)目比對照組明顯增加，而且內(nèi)、外核層均見陽性細胞。

本研究中，b波振幅明顯升高。視網(wǎng)膜神經(jīng)細胞的超微結(jié)構(gòu)明顯好轉(zhuǎn)，視網(wǎng)膜病理損害逐漸減弱，視網(wǎng)膜神經(jīng)細胞的凋亡指數(shù)顯著下降，說明葛根素對早期DM大鼠的神經(jīng)視網(wǎng)膜具有一定保護作用。

目前已證實，在DM狀態(tài)下視網(wǎng)膜氧化應(yīng)激加劇，高血糖和氧化應(yīng)激的主要靶點是NF-κB，并通過其調(diào)控與炎癥、細胞增生和細胞分化等密切相關(guān)的多種基因的表達，促進細胞凋亡和新生血管的生成。Romeo等［3］研究認(rèn)為視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞在DM早期即出現(xiàn)NF-κB活化，說明缺氧誘導(dǎo)了NF-κB活化。NF-κB被高血糖激活后，可控制視網(wǎng)膜周細胞的凋亡，并介導(dǎo)單核細胞與血管內(nèi)皮的黏附性增加，從而導(dǎo)致視網(wǎng)膜血管的硬化，加重DM視網(wǎng)膜血管的病變，造成視網(wǎng)膜組織的缺血缺氧。在DM患者的玻璃體和視網(wǎng)膜毛細血管中NF-κB活性比非DM患者增強，NF-κB活性增強與周細胞的喪失和無細胞血管的發(fā)生成正相關(guān)［4］。

本研究結(jié)果顯示，DM組視網(wǎng)膜NF-κB p65表達較正常對照組明顯增強，以神經(jīng)節(jié)細胞為主，內(nèi)外核層細胞均有存在。提示葛根素減輕DM大鼠神經(jīng)視網(wǎng)膜的損傷在一定程度上可能是因為抑制了DM引起的視網(wǎng)膜中NF-κB的激活，而NF-κB得以活化與DM大鼠視網(wǎng)膜中氧自由基的產(chǎn)生有關(guān)。但其具體的信號傳導(dǎo)通路有待于進一步的研究。

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