張曉琳，張明潔，許 靜，楊 卓

(南開(kāi)大學(xué)醫(yī)學(xué)院臨床醫(yī)學(xué)系神經(jīng)生理學(xué)實(shí)驗(yàn)室，天津 300071)

槲皮素(quercetin)及其衍生物為一類(lèi)天然黃酮類(lèi)化合物，是人類(lèi)飲食中最主要的生物類(lèi)黃酮，具有廣泛的藥理作用［1－2］。近年研究發(fā)現(xiàn)，槲皮素具有顯著的抗腫瘤作用，其對(duì)體外培養(yǎng)的多種癌細(xì)胞如HL-60，HELE，HepG2，HeLa 等具有抑制增殖及誘導(dǎo)凋亡 的 作 用［3－5］。熱 激 蛋 白 (heat shock protein，HSP)是一組高度保守的蛋白質(zhì)，作為細(xì)胞受損的標(biāo)志、神經(jīng)保護(hù)因子，其對(duì)神經(jīng)細(xì)胞的損傷有保護(hù)作用。目前研究證實(shí)，機(jī)體受到各種刺激，如高溫、缺氧、氧化應(yīng)激、感染、創(chuàng)傷和代謝毒物等作用時(shí)，細(xì)胞誘導(dǎo)產(chǎn)生HSP70，增強(qiáng)細(xì)胞對(duì)損害的耐受力，維持細(xì)胞正常功能，提高生存率。因此，本研究通過(guò)檢測(cè)槲皮素對(duì)熱應(yīng)激后神經(jīng)膠質(zhì)瘤C6細(xì)胞凋亡及HSP70表達(dá)水平的影響，進(jìn)一步探討槲皮素抗腫瘤的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 藥物、試劑及儀器

槲皮素，二甲基噻唑二苯基四唑溴鹽(MTT)及凝膠電泳所用試劑均購(gòu)自美國(guó)Sigma公司。DMEM培養(yǎng)基(美國(guó)，Gibco公司);胎牛血清(中國(guó)，蘭州民海生物工程有限公司);青霉素和鏈霉素(中國(guó)，哈藥集團(tuán));胰蛋白酶(美國(guó)，Amerseco公司);Parafilm膜(美國(guó)，Parafilm公司);雙金雞鈉酸、蛋白定量試劑盒(中國(guó)，南京建成公司);聚偏二氟乙烯(PVDF)膜和ECL發(fā)光試劑盒(美國(guó)，Millipore公司);二甲亞砜(DMSO，中國(guó)，上海生工公司);annexinⅤ-FITC凋亡試劑盒(中國(guó)，凱基生物);β肌動(dòng)蛋白小鼠單克隆抗體、HSP70小鼠單克隆抗體和辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記兔抗鼠IgG(美國(guó)，Santa Cruz公司)。

倒置相差顯微鏡(日本，Olympus公司)，酶標(biāo)儀(美國(guó)，BIO-TEK公司)，日本產(chǎn)奧林巴斯顯微鏡。流式細(xì)胞儀(美國(guó)，BD公司)。低溫離心機(jī)(德國(guó)，Hettich公司)。

1.2 細(xì)胞株

C6細(xì)胞株來(lái)源于美國(guó)標(biāo)準(zhǔn)菌種收藏所(ATCC)，購(gòu)自中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院上海細(xì)胞生物學(xué)研究所。C6細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)于含有10%胎牛血清、青霉素100 kU·L－1、鏈霉素 100 kU·L－1的 DMEM 培養(yǎng)基中，在37℃，5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.3 MTT法檢測(cè)細(xì)胞存活率

C6細(xì)胞用含有10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基稀釋至1×108L－1，將細(xì)胞接種至96孔培養(yǎng)板，每孔加入細(xì)胞懸液200 μl(空白孔不加細(xì)胞，只加培養(yǎng)基，用于酶標(biāo)儀測(cè)定時(shí)調(diào)零)，在37℃和5%CO2的條件下貼壁培養(yǎng)24 h。觀察細(xì)胞的生長(zhǎng)情況，至細(xì)胞長(zhǎng)滿80%左右，換成無(wú)血清DMEM培養(yǎng)基后再培養(yǎng)24 h，使細(xì)胞同步化;然后分別加入含槲皮素0，50，100，150 和 200 μmol·L－1的無(wú)血清培養(yǎng)基，每個(gè)劑量重復(fù)6孔，每組重復(fù)3次。以上體系置培養(yǎng)箱中孵育1 h后培養(yǎng)板周邊用Parafilm膜密封，于42℃水浴中加熱1 h，然后在37℃，5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12 h。按以上方法處理細(xì)胞后，吸棄培養(yǎng)基后換入新培養(yǎng)基，每孔 180 μl。每孔加入 20 μl濃度為 MTT 20 mg·L－1(終濃度為 5 mg·L－1)，置 CO2培養(yǎng)箱中孵育4 h，吸棄培養(yǎng)基，每孔加入150 μl DMSO終止反應(yīng)，混懸15 min，以空白孔調(diào)零，在吸收波長(zhǎng)為490 nm條件下，用酶標(biāo)儀測(cè)定各孔的吸光度值(A)。細(xì)胞存活率(%)=藥物處理組A490nm值/加熱對(duì)照A490nm值×100%。

1.4 Hoechst/PI雙染法檢測(cè)細(xì)胞凋亡

大約 5×109L－1的細(xì)胞于 37℃ 中與 Hoechst33342(10 μg·ml－1)孵育 15 min 后，離心、用PBS漂洗1次，重懸為密度大約2.5×1010L－1。上機(jī)檢測(cè)前加入1 ml PI 25 mg·L－1。熒光顯微鏡(激發(fā)濾色鏡波長(zhǎng):330～380 nm;吸收濾色鏡波長(zhǎng):420 nm)觀察細(xì)胞。每處理組至少計(jì)數(shù)200個(gè)細(xì)胞，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.5 AnnexinV-FITC/PI雙染法檢測(cè)細(xì)胞凋亡百分率

C6細(xì)胞以每孔1×105密度接種于6孔板，分別加入槲皮素0，50，100 和200 μmol·L－1，培養(yǎng)箱中孵育1 h。然后培養(yǎng)板周邊用Parafilm膜密封，于42℃水浴加熱1 h，然后37℃，5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12 h。除去培養(yǎng)液，4℃預(yù)冷的PBS液洗2次，加胰酶消化，收集細(xì)胞于15 ml離心管中，831×g離心后棄去上清液，以PBS清洗沉淀1次，再重復(fù)離心、清洗1次。最后用500 μl結(jié)合緩沖液重新懸浮細(xì)胞，避光加入 5 μl annexinⅤ-FITC、5 μl PI，混勻后室溫避光孵育15 min，進(jìn)行流式細(xì)胞術(shù)分析。

1.6 Western印跡法檢測(cè)HSP70表達(dá)

細(xì)胞以每孔1×105密度接種于6孔培養(yǎng)板，并隨機(jī)分為3組:正常對(duì)照組，正常培養(yǎng)細(xì)胞;加熱組，以Parafilm膜密封6孔板，42℃加熱1 h后在培養(yǎng)箱中恢復(fù)培養(yǎng)12 h;槲皮素處理組，用含槲皮素200 μmol·L－1的培養(yǎng)基在培養(yǎng)箱中孵育 1 h，隨后處理同加熱組。按照分組條件處理結(jié)束后，用預(yù)冷PBS緩沖液洗3次，并在每孔中加入50μl細(xì)胞裂解液(PMSF 10 mmol·L－1;Tris·HCl 1 mol·L－1，pH 8.0;NaCl 0.15 mol·L－1;1%Triton X-100;5%Cooktail)。分別收集3組細(xì)胞于1.5 ml Eppendorf離心管中，在冰上充分裂解至少30 min后，在低溫離心機(jī)中以4℃，831×g離心10 min。取上清液于新的Eppendorf離心管中，用雙金雞鈉酸法進(jìn)行蛋白定量后，加入5 × 上樣緩沖液(Tris·HCl 0.5 mol·L－1，pH 6.8;50%甘油，DTT 78 g·L－1，SDS 100 g·L－1，溴酚藍(lán)5 g·L－1)。煮沸后，分裝后存于－70℃冰箱備用。

樣本(每個(gè)泳道上樣20 μl，含總蛋白15 μg)經(jīng)8%SDS-PAGE蛋白電泳分離后，轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，用5%脫脂奶粉封閉2 h。隨后分別加入HSP70單克隆抗體(1∶5000)和β肌動(dòng)蛋白單克隆抗體(1∶2500)4℃孵育過(guò)夜。TBST洗膜3次，每次10 min，加入二抗(1∶4000)室溫孵育1 h，TBST洗膜5次，每次10 min。ECL發(fā)光試劑顯影后，用Gel-Pro Analyzer軟件進(jìn)行積分吸光度分析。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 槲皮素對(duì)熱應(yīng)激后神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞存活率的影響

表1結(jié)果顯示，與正常對(duì)照組相比，加熱對(duì)細(xì)胞存活率無(wú)明顯影響。與加熱組相比，槲皮素50 μmol·L－1組細(xì)胞存活率為(103 ±4)%，無(wú)明顯改變，而槲皮素 100 μmol·L－1組細(xì)胞存活率明顯降低(P ＜0.05)，槲皮素 150 μmol·L－1及 200 μmol·L－1組的細(xì)胞存活率分別為(77±4)%和(75±5)%，顯著降低(P＜0.01)，呈濃度依賴(lài)性(r=0.94，P ＜0.05)。說(shuō)明槲皮素能明顯抑制C6細(xì)胞增殖。

表1 槲皮素對(duì)熱應(yīng)激后神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞存活率的影響Tab.1 Effect of quercetin on heat-induced glioma cell survival

2.2 槲皮素對(duì)熱應(yīng)激后神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞凋亡的影響

圖1 Hoechst/PI檢測(cè)結(jié)果顯示，與正常對(duì)照組相比，加熱對(duì)照組細(xì)胞凋亡率(7±2)%無(wú)明顯改變。與加熱對(duì)照組相比，槲皮素 50，100及 200 μmol·L－1組細(xì)胞凋亡率分別為(14±3)%，(23±6)%和(39±7)%，均有顯著增加(P ＜0.05，P ＜0.01)。

表2和圖2 annexinⅤ-FITV/PI檢測(cè)結(jié)果顯示，與正常對(duì)照組相比，加熱對(duì)照組細(xì)胞早期凋亡率和晚期凋亡率均無(wú)明顯改變;與加熱對(duì)照組相比，槲皮素 50 μmol·L－1組細(xì)胞早期凋亡率顯著增加，而晚期凋亡率無(wú)明顯改變，而槲皮素100和200 μmol·L－1組細(xì)胞早期和晚期凋亡率均顯著增加(P ＜0.05，P ＜0.01)，細(xì)胞凋亡率最高為 59%。說(shuō)明槲皮素處理C6細(xì)胞后，細(xì)胞早期凋亡與晚期凋亡率均顯著增加。

表2 槲皮素對(duì)熱應(yīng)激后神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞凋亡率的影響Tab.2 Effect of quercetin on the rate of heat-induced glioma cell apoptosis

圖1 Hoechst/PI雙染法檢測(cè)槲皮素對(duì)熱應(yīng)激后神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞凋亡的影響(×400).分組處理見(jiàn)表1.A:正常對(duì)照組;B:加熱對(duì)照組;C:加熱 +槲皮素50 μmol·L－1;D:加熱 +槲皮素100 μmol·L－1;E:加熱 +槲皮素200 μmol·L－1.箭頭示凋亡的細(xì)胞.Fig.1 Effect of quercetin on heat-induced cell apoptosis detected by Hoechst/PI staining(×400).

圖2 AnnexinV-FITC/PI檢測(cè)槲皮素對(duì)熱應(yīng)激后神經(jīng)膠瘤細(xì)胞凋亡的影響.分組處理見(jiàn)表1.A:正常對(duì)照組;B:加熱對(duì)照組;C:加熱 +槲皮素50 μmol·L－1;D:加熱 +槲皮素100 μmol·L－1;E:加熱 +槲皮素200 μmol·L－1.Fig.2 Effect of quercetin on heat-induced glioma cell apoptosis detected by annexinV-FITC/PI.

2.3 槲皮素對(duì)熱應(yīng)激后神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞HSP70蛋白表達(dá)的影響

如圖3所示，加熱組HSP70表達(dá)水平從正常對(duì)照組的0.22 ±0.01 升高到0.36 ±0.02，升高了39%(P ＜ 0.01)，槲皮素 200 μmol·L－1處理后降低至0.17 ±0.01，降低了53%(P ＜0.01)。

圖3 Western印跡檢測(cè)槲皮素對(duì)熱應(yīng)激后神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞熱激蛋白70(HSP70)表達(dá)的影響.分組處理見(jiàn)表1.條帶1:正常對(duì)照組;條帶2:加熱對(duì)照組;條帶3:加熱+槲皮素200 μmol·L－1組.Fig.3 Effect of quercetin on the expression of heat shock protein 70(HSP70)in heat-induced glioma cells by Western blotting.

3 討論

研究表明，通過(guò)誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡增強(qiáng)腫瘤治療效果是目前腫瘤藥物治療的重要途徑，槲皮素的抗腫瘤作用及其與誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的關(guān)系是目前研究的熱點(diǎn)之一。文獻(xiàn)報(bào)道槲皮素可以通過(guò)抑制Bcl-2蛋白表達(dá)、促進(jìn)P53蛋白表達(dá)誘導(dǎo)大鼠腦膠質(zhì)瘤C6細(xì)胞凋亡［6］，以及阻滯細(xì)胞增殖周期［7］、上調(diào)胱天蛋白酶 3［8］、抑制 HSP70 表達(dá)［9］以及改變線粒體膜電位［10－11］等途徑抑制不同種類(lèi)的腫瘤細(xì)胞增殖，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。本研究結(jié)果表明不同濃度的槲皮素處理后C6細(xì)胞存活率明顯降低，且證實(shí)C6細(xì)胞存活率降低主要是由于槲皮素引起了C6細(xì)胞凋亡。

作為分子伴侶，HSP主要參與新生多肽的折疊并參與抗原提呈、激素受體、細(xì)胞核受體結(jié)合和凋亡的過(guò)程，對(duì)維持細(xì)胞正常的生理功能發(fā)揮重要作用［12－16］。1982 年 Adams 等［15］證實(shí)，生物細(xì)胞(包括原核細(xì)胞和真核細(xì)胞)溫度增高時(shí)均可合成一類(lèi)具有生物學(xué)活性及其多種生理功能的蛋白質(zhì)，即誘導(dǎo)型HSP。Western印跡結(jié)果顯示，42℃熱應(yīng)激處理后HSP70表達(dá)明顯高于正常細(xì)胞，而槲皮素處理后，HSP70表達(dá)水平明顯低于加熱對(duì)照組，這表明槲皮素抑制了熱應(yīng)激后C6細(xì)胞HSP70的表達(dá)。

研究證實(shí)，下調(diào)HSP70的表達(dá)可以抑制SMMC-7721細(xì)胞增殖并誘導(dǎo)其凋亡［17］。HSP70呈高表達(dá)現(xiàn)象并可能與腫瘤細(xì)胞中錯(cuò)誤折疊的蛋白高表達(dá)，對(duì)HSP70的再折疊功能的需求增加有關(guān)，或是由于腫瘤內(nèi)微環(huán)境中低氧、葡萄糖供給不足更適宜HSP70蛋白的高表達(dá)［18－20］。這種異?；钴S的代謝需要更多的HSP70來(lái)調(diào)節(jié)和穩(wěn)定，同時(shí)腫瘤細(xì)胞中突變或異常蛋白質(zhì)的存在刺激HSP70的合成，使其呈現(xiàn)高表達(dá)水平;另一方面，大量表達(dá)的HSP70又通過(guò)下調(diào)凋亡相關(guān)基因、蛋白及蛋白酶活性而抑制細(xì)胞凋亡，使細(xì)胞進(jìn)一步異常增殖［20］。因此，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明槲皮素誘導(dǎo)熱應(yīng)激后C6細(xì)胞凋亡的可能機(jī)制與抑制熱應(yīng)激后HSP70的表達(dá)有關(guān)，為深入闡明槲皮素誘導(dǎo)C6細(xì)胞凋亡的機(jī)制提供重要依據(jù)。

［1］ Liu Y，Ehtesham M，Samoto K，Wheeler CJ，Thompson RC，Villarreal LP，et al.In situ adenoviral interleukin 12 gene transfer confers potent and long-lasting cytotoxic immunity in glioma［J］.Cancer Gene Ther，2002，9(1):9-15.

［2］ Chen J，Li SL，Li P，Song Y，Chai XY，Ma DY.Qualitative and quantitative analysis of active flavonoids in Flos Lonicerae by capillary zone electrophoresis coupled with solid-phase extraction［J］.J Sep Sci，2005，28(4):365-372.

［3］ Tsung K，Dolan JP，Tsung YL，Norton JA.Macrophages as effector cells in interleukin 12-induced T celldependent tumor rejection［J］.Cancer Res，2002，62(17):5069-5075.

［4］ 黃麗瓊，張 蔚，楊 洋，陶 璐.槲皮素對(duì)子宮頸癌HeLa細(xì)胞的作用及其機(jī)制［J］.中華婦產(chǎn)科雜志，2009，44(6):436-439.

［5］ Tan J，Wang B，Zhu L.Regulation of survivin and Bcl-2 in HepG2 cell apoptosis induced by quercetin［J］.Chem Biodivers，2009，6(7):1101-1110.

［6］ 周立祥，羅毅男，付雙林，葛鵬飛，莊漢亭.槲皮素對(duì)大鼠腦膠質(zhì)瘤C6細(xì)胞增殖調(diào)控的作用［J］.吉林大學(xué)學(xué)報(bào)(醫(yī)學(xué)版)，2006，32(2):251－253，256.

［7］ Vijayababu MR，Kanagaraj P，Arunkumar A，Ilangovan R，AruldhasMM， ArunakaranJ. Quercetin-induced growth inhibition and cell death in prostatic carcinoma cells(PC-3)are associated with increase in p21 and hypophosphorylated retinoblastoma proteins expression［J］.J Cancer Res Clin Oncol，2005，131(11):765-771.

［8］ Granado-Serrano AB， Martín MA， Bravo L， Goya L，Ramos S.Quercetin induces apoptosis via caspase activation，regulation of Bcl-2，and inhibition of PI-3-kinase/Akt and ERK pathways in a human hepatoma cell line(HepG2)［J］.J Nutr，2006，136(11):2715-2721.

［9］ Dudeja V，Mujumdar N，Phillips P，Chugh R，Borja-Cacho D，Dawra RK，et al.Heat shock protein 70 inhibits apoptosis in cancer cells through simultaneous and independent mechanisms［J］.Gastroenterology，2009，136(5):1772-1782.

［10］ Kothan S，Dechsupa S，Leger G，Moretti JL，Vergote J， Mankhetkorn S. Spontaneous mitochondrial membrane potential change during apoptotic induction by quercetin in K562 and K562/adr cells［J］.Can J Physiol Pharmacol，2004，82(12):1084-1090.

［11］ Baptiste-Okoh N， Barsotti AM， Prives C. A role for caspase 2 and PIDD in the process of p53-mediated apoptosis［J］.Proc Natl Acad Sci USA，2008，105(6):1937-1942.

［12］ Kiang JG， Tsokos GC. Heatshock protein 70 kDa:molecular biology，biochemistry，and physiology［J］.Pharmacol Ther，1998，80(2):183-201.

［13］ Sharp FR，Massa SM，Swanson RA.Heat-shock protein protection［J］.Trends Neurosci，1999，22(3):97-99.

［14］ Ohata S，Moriyama C，Yamashita A，Nishida T，Kusumoto C，Mochida S，et al.Polaprezinc protects mice against endotoxin shock［J］.J Clin Biochem Nutr，2010，46(3):234-243.

［15］ Adams C，Rinne RW.Stress protein formation:gene expression and environmental interaction with evolutionary significance［J］.Int Rev Cytol，1982，79:305-315.

［16］ Yenari MA，Giffard RG，Sapolsky RM，Steinberg GK.The neuroprotective potential of heat shock protein 70(HSP70)［J］.Mol Med Today，1999，5(12):525-531.

［17］ Yang X， He H， Yang W， Song T，Guo C，Zheng X，et al.Effects of HSP70 antisense oligonucleotide on the proliferation and apoptosis of human hepatocellular carcinoma cells［J］.J Huazhong Univ Sci Technol Med Sci，2010，30(3):337-343.

［18］Ka＇zmierczuk A，Kiliańska ZM.The pleiotropic activity of heat-shock proteins［J］.Postepy Hig Med Dosw(Online)，2009，63:502-521.

［19］ Dudeja V，Vickers SM，Saluja AK.The role of heat shock proteins in gastrointestinal diseases［J］.Gut，2009，58(7):1000-1009.

［20］ Lee YJ，Curetty L，Hou ZZ，Kim SH，Kim JH，Corry PM.Effect of pH on quercetin-induced suppression of heat shock gene expression and thermotolerance development in HT-29 cells［J］.Biochem Biophys Res Commun，1992，186(2):1121-1128.