陸彩玲，吳元楨，唐付華，劉楠楠，黃 玲，郭松超

(廣西醫(yī)科大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院營(yíng)養(yǎng)與食品衛(wèi)生學(xué)教研室，廣西南寧 530021)

錳是生物必需的微量元素之一，參與各種重要的生理過(guò)程，包括蛋白質(zhì)、脂質(zhì)及碳水化合物等大分子的代謝，機(jī)體正常的免疫功能，與細(xì)胞ATP結(jié)合調(diào)節(jié)細(xì)胞能量代謝，維持正常的骨骼生長(zhǎng)及連接組織功能。然而，短期高濃度職業(yè)錳暴露或生活環(huán)境長(zhǎng)期低濃度錳暴露易誘發(fā)神經(jīng)精神異常，包括記憶損傷、學(xué)習(xí)能力下降及易怒、沖動(dòng)、焦慮、強(qiáng)迫行為和幻覺(jué)等［1］。近期人群流行病學(xué)調(diào)查［2］及動(dòng)物實(shí)驗(yàn)［3］研究表明，長(zhǎng)期錳暴露導(dǎo)致人或受試動(dòng)物學(xué)習(xí)記憶能力受損。迄今為止關(guān)于錳暴露與運(yùn)動(dòng)或行為異常間的關(guān)系已有臨床觀察和動(dòng)物研究報(bào)道，但錳暴露對(duì)認(rèn)知能力的影響及其發(fā)生機(jī)制報(bào)道甚少。學(xué)習(xí)記憶是復(fù)雜的過(guò)程，海馬與學(xué)習(xí)記憶密切相關(guān)，而乙酰膽堿(acetylcholine，ACh)則是介導(dǎo)學(xué)習(xí)記憶的重要神經(jīng)遞質(zhì)，因此，本研究擬建立急性染錳的動(dòng)物模型后并給予?；撬岣深A(yù)，通過(guò)水迷宮實(shí)驗(yàn)觀察大鼠的空間學(xué)習(xí)能力、空間記憶能力的改變，測(cè)定海馬組織乙酰膽堿酯酶(acetylcholine esterase，AChE)及膽堿O-乙酰轉(zhuǎn)移酶(choline O-acetyltransferase，ChAT)活力以指示ACh含量，探討錳誘導(dǎo)大鼠空間學(xué)習(xí)記憶損傷的分子機(jī)制及?；撬釋?duì)錳中毒的干預(yù)作用。

1 材料與方法

1.1 試劑及儀器

MnCl2·4H2O和?；撬?Sigma公司)。Morris水迷宮系統(tǒng)，UV-1700紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)(日本島津);721分光光度計(jì)，Hettich臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)和微量電動(dòng)組織勻漿機(jī)(瑞士Kimble公司)。BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒(P0012)(碧云天生物技術(shù)研究所);AChE測(cè)試盒，批號(hào)為20100612，和ChAT測(cè)試盒，批號(hào)為20100612(南京建成生物工程研究所)。

1.2 動(dòng)物、實(shí)驗(yàn)分組及給藥

SPF雄性SD大鼠，體質(zhì)量160～200 g，廣西醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，動(dòng)物許可證號(hào):SCXK桂2009-0002，習(xí)慣性喂飼1周后隨機(jī)進(jìn)入牛磺酸預(yù)防實(shí)驗(yàn)和?；撬嶂委煂?shí)驗(yàn)。

1.2.1 ?；撬犷A(yù)防實(shí)驗(yàn)

60只大鼠分為正常對(duì)照組，染錳對(duì)照組和染錳+?；撬犷A(yù)防組。正常對(duì)照組連續(xù)ip給予0.9%生理鹽水4周，染錳對(duì)照組連續(xù)ip給予MnCl2·4H2O 15 mg·kg－1溶液，連續(xù)染毒4周，牛磺酸預(yù)防組則染錳的同時(shí)ip給予?；撬?00 mg·kg－1，持續(xù)4周。

1.2.2 ?；撬嶂委煂?shí)驗(yàn)

40只大鼠分為染錳對(duì)照組及染錳+?；撬嶂委熃M。所有大鼠均ip給予MnCl2·4H2O 4周后，染錳對(duì)照組改為ip給予生理鹽水4周，而染錳+?；撬嶂委熃M則改為ip給予牛磺酸200 mg·kg－14周，共8周。

1.3 水迷宮實(shí)驗(yàn)

動(dòng)物干預(yù)結(jié)束后進(jìn)行水迷宮實(shí)驗(yàn)測(cè)定學(xué)習(xí)記憶能力變化。水迷宮系統(tǒng)由一個(gè)直徑為1.5 m的黑色不銹鋼水池，隱藏在水下2 cm的平臺(tái)，水池上方的圖像采集系統(tǒng)和水槽外的處理系統(tǒng)組成。將大鼠面向池壁分別自Ⅰ，Ⅱ，Ⅲ和Ⅳ4個(gè)象限放入水池，攝像系統(tǒng)攝取大鼠90 s內(nèi)在圓池內(nèi)游泳找到隱藏在水下2 cm平臺(tái)的時(shí)間、路程及速度等參數(shù)，每天4次，連續(xù)5 d。以大鼠潛伏逃避時(shí)間作為評(píng)價(jià)。6 d則撤除平臺(tái)，自任一象限內(nèi)將大鼠投入水池，觀察動(dòng)物90 s內(nèi)通過(guò)原平臺(tái)的次數(shù)(平臺(tái)搜索次數(shù))進(jìn)一步評(píng)價(jià)大鼠的空間記憶能力。水迷宮周?chē)鷶[放物品及大鼠各象限入水點(diǎn)實(shí)驗(yàn)期間固定不變。

1.4 AChE 活力測(cè)定

去除雙側(cè)大腦皮質(zhì)，取左、右兩側(cè)半月形海馬，稱(chēng)重后按試劑盒要求加入9倍體積的生理鹽水制成10%的組織勻漿，1164×g離心10 min后取上清40 μl按試劑操作程序測(cè)定AChE活力，同時(shí)用BCA法定量海馬組織勻漿中蛋白含量。

1.5 ChAT 活力測(cè)定

將上述10%海馬組織勻漿稀釋至5%，測(cè)定ChAT活力。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 ?；撬釋?duì)染錳大鼠逃避潛伏期及平臺(tái)搜索次數(shù)的影響

2.1.1 預(yù)防性給予牛磺酸

由表1可知，與正常對(duì)照組比較，急性染錳大鼠潛伏逃避時(shí)間顯著延長(zhǎng)(P＜0.05)，搜到目標(biāo)區(qū)域稍有減少，但并不明顯。染錳同時(shí)給予?；撬犷A(yù)防大鼠的潛伏逃避時(shí)間恢復(fù)至正常水平。錳染毒及預(yù)防性給予牛磺酸對(duì)搜索目標(biāo)區(qū)域的有效次數(shù)無(wú)影響，與正常對(duì)照組相比無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

表1 預(yù)防性給予牛磺酸對(duì)染錳大鼠水迷宮逃避潛伏期及平臺(tái)搜索次數(shù)的影響Tab.1 Effect of taurine pretreatment on escape latency and probe times in rats exposed to manganese chloride

2.1.2 治療性給予?；撬?/p>

由表2可知，大鼠染錳后給予治療?；撬岷鬂摲颖軙r(shí)間較染錳對(duì)照組明顯縮短(P＜0.05)，搜到目標(biāo)區(qū)的有效次數(shù)與治療對(duì)照組相比并無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

表2 治療性給予?；撬釋?duì)染錳大鼠水迷宮逃避潛伏期及平臺(tái)搜索次數(shù)的影響Tab.2 Effect of taurine treatment on escape latency and probe times in rats exposed to manganese chloride

2.2 ?；撬釋?duì)染錳大鼠海馬組織乙酰膽堿酯酶及膽堿O-乙酰轉(zhuǎn)移酶活力的影響

2.2.1 預(yù)防性給予?；撬?/p>

由表3可知，與正常對(duì)照組相比，染錳稍稍降低海馬組織AChE及ChAT活力，但并無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。同時(shí)給予?；撬犷A(yù)防可以明顯下調(diào)海馬組織中AChE活力(P＜0.05)，但對(duì) ChAT活力影響也不明顯。

2.2.2 治療性給予?；撬?/p>

表4結(jié)果表明，染錳后予以?；撬嶂委?，?；撬峋茱@著提高AChE及ChAT活力(P＜0.05)。

表3 預(yù)防性給予?；撬釋?duì)染錳大鼠海馬組織乙酰膽堿酯酶(AChE)及膽堿O-乙酰轉(zhuǎn)移酶(ChAT)活力的影響Tab.3 Effect of taurine pretreatment on acetylcholine esterase(AChE)and choline O-acetyltransferase(ChAT)activities in hippocampus of rats exposed to manganese chloride

表4 治療性給予牛磺酸對(duì)染錳大鼠海馬組織AChE及ChAT活力的影響Tab.4 Effect of taurine treatment on AChE and ChAT activities in hippocampus of rats exposed to manganese chloride

3 討論

本研究發(fā)現(xiàn)急性染錳后大鼠學(xué)習(xí)能力出現(xiàn)顯著下降，記憶能力也略有降低。并且錳暴露后即便脫離染毒環(huán)境如不予以有效干預(yù)學(xué)習(xí)記憶能力依然不能自主恢復(fù)而改變錳的既定毒效，且有可能較脫離初期更嚴(yán)重，這可能與錳不斷累積于腦組織且一旦進(jìn)入難以清除有關(guān)。隨著對(duì)學(xué)習(xí)記憶研究的深入，認(rèn)為該生理過(guò)程涉及大腦高級(jí)神經(jīng)中樞特定的解剖部位、神經(jīng)環(huán)路及神經(jīng)遞質(zhì)。大鼠空間航行記憶能力依賴(lài)于海馬結(jié)構(gòu)并與膽堿能神經(jīng)遞質(zhì)相關(guān)［4］。ACh沖動(dòng)傳入與運(yùn)動(dòng)、認(rèn)知、情緒及行為密切相關(guān)，AChE和ChAT分別是分解和合成介導(dǎo)學(xué)習(xí)記憶重要的神經(jīng)遞質(zhì)—ACh的兩個(gè)重要酶。本研究發(fā)現(xiàn)，急性染錳后海馬AChE活力稍有降低，與國(guó)外有關(guān)急性染錳后AChE升高的報(bào)道［5］相反，該差異可能與錳暴露動(dòng)物的年齡、暴露途徑、染錳劑量和染錳時(shí)間長(zhǎng)短以及檢測(cè)的腦區(qū)不同都有關(guān)［6－8］。本研究中急性染錳輕微抑制海馬ChAT活力，與國(guó)外研究認(rèn)為長(zhǎng)期染錳可能僅導(dǎo)致紋狀體的ChAT活力顯著降低，其他腦區(qū)并無(wú)明顯變化一致［9］?？傊?，急性錳暴露導(dǎo)致大鼠空間學(xué)習(xí)記憶障礙極其復(fù)雜，除膽堿能系統(tǒng)外，可能尚有其他機(jī)制或者其他腦區(qū)的膽堿能系統(tǒng)參與錳對(duì)大鼠學(xué)習(xí)記憶的損傷，如有報(bào)道Mn2+也可以作為N-甲基-D-天門(mén)冬氨酸受體通道抑制劑而導(dǎo)致學(xué)習(xí)記憶損傷［10］。

牛磺酸是一種具有多種生理功能并能在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中發(fā)揮重要作用的一種化合物［11－12］。臨床上牛磺酸已廣泛用于老年癡呆和老年神經(jīng)異常等多種疾病的治療。而有研究認(rèn)為，?；撬岜旧韺?duì)學(xué)習(xí)記憶并無(wú)改善作用，但能有效地對(duì)抗各種誘導(dǎo)學(xué)習(xí)記憶障礙的化合物如戊巴比妥鈉和亞硝酸鈉等物質(zhì)導(dǎo)致的學(xué)習(xí)記憶能力損傷［13］。本研究也發(fā)現(xiàn)?；撬崮芨纳棋i誘導(dǎo)的空間學(xué)習(xí)能力下降，這可能部分與?；撬釋?duì)膽堿能神經(jīng)系統(tǒng)的療效有關(guān)。但?；撬犷A(yù)防和治療對(duì)乙酰膽堿系統(tǒng)改變可能存在時(shí)程差異，即?；撬犷A(yù)防性給予時(shí)主要顯示下調(diào)AChE活力，減少ACh分解，而錳暴露后?；撬岬闹委熜越o予則上調(diào)ChAT活力增加ACh合成，最終達(dá)到提高體內(nèi)ACh含量，增強(qiáng)神經(jīng)突觸的興奮從而改善學(xué)習(xí)記憶能力。但牛磺酸對(duì)錳誘導(dǎo)學(xué)空間習(xí)記憶能力損傷的改善機(jī)制，對(duì)ACh系統(tǒng)影響的時(shí)間差異都有待進(jìn)一步研究。

［1］ Josephs KA，Ahlskog JE，Klos KJ，Kumar N，F(xiàn)ealey RD，Trenerry MR，et al.Neurologic manifestations in welders with pallidal MRI T1 hyperintensity［J］.Neurology，2005，64(12):2033-2039.

［2］ Klos KJ，Chandler M，Kumar N，Ahlskog JE，Josephs KA.Neuropsychological profiles of manganese neurotoxicity［J］.Eur J Neurol，2006，13(10):1139-1141.

［3］ Schneider JS，Decamp E，Koser AJ，F(xiàn)ritz S，Gonczi H，Syversen T，et al.Effects of chronic manganese exposure on cognitive and motor functioning in non-human primates［J］.Brain Res，2006，1118(1):222-231.

［4］ Carlson ES，Tkac I，Magid R，O'Connor MB，Andrews NC，Schallert T，et al.Iron is essential for neuron development and memory function in mouse hippocampus［J］.J Nutr，2009，139(4):672-679.

［5］ Liapi C，Zarros A，Galanopoulou P，Theocharis S，Skandali N，Al-Humadi H，et al.Effects of short-term exposure to manganese on the adult rat brain antioxidant status and the activities of acetylcholinesterase，(Na，K)-ATPase and Mg-ATPase:modulation by L-cysteine［J］.Basic Clin Pharmacol Toxicol，2008，103(2):171-175.

［6］ Martínez H，Bonilla E.Water intake and brain cholineacetyltransferase and acetylcholinesterase activities in manganese treated rats［J］.Neurobehav Toxicol Teratol，1981，3(3):277-280.

［7］ Lai JC，Leung TK，Lim L.Differences in the neurotoxic effects of manganese during development and aging:some observations on brain regional neurotransmitter and non-neurotransmitter metabolism in a developmental rat model of chronic manganese encephalopathy［J］.Neurotoxicology，1984，5(1):37-47.

［8］ Lai JC，Chan AW，Leung TK，Minski MJ，Lim L.Neurochemical changes in rats chronically treated with a high concentration of manganese chloride［J］.Neurochem Res，1992，17(9):841-847.

［9］ Lai JC，Leung TK，Lim L.Brain regional distribution of glutamic acid decarboxylase，choline acetyltransferase，and acetylcholinesterase in the rat:effects of chronic manganese chloride administration after two years［J］.J Neurochem，1981，36(4):1443-1448.

［10］ Newcomer JW，Krystal JH.NMDA receptor regulation of memory and behavior in humans［J］.Hippocampus，2001，11(5):529-542.

［11］ Huxtable RJ.Taurine in the central nervous system and the mammalian actions of taurine［J］.Prog Neurobiol，1989，32(6):471-533.

［12］ Huxtable RJ.Physiological actions of taurine［J］.Physiol Rev，1992，72(1):101-163.

［13］ Vohra BP，Hui X.Improvement of impaired memory in mice by taurine［J］.Neural Plast，2000，7(4):245-259.