李國熊，周 濤，周 恒，許重遠，徐江平

(南方醫(yī)科大學(xué)1.藥學(xué)院神經(jīng)藥理學(xué)科，2.南方醫(yī)院國家藥物臨床試驗機構(gòu)，廣東廣州 510515)

咯利普蘭(rolipram，Rol)為磷酸二酯酶－4(phosphodiesterase 4，PDE4)高效選擇性抑制劑，在動物實驗及臨床試驗中證明了它對大多數(shù)抑郁癥療效明確，同時還具有增強動物學(xué)習(xí)記憶、改善認(rèn)知等多種功能［1］。但是Rol帶來的不良反應(yīng)特別是惡心嘔吐令健康志愿者和抑郁癥患者難以忍受，從而限制了它的臨床應(yīng)用［2］。雖然在Rol的基礎(chǔ)上合成了一些效價強度更高的化合物如吡拉米司特(piclamilast)，CDP840，但是仍然避免不了惡心嘔吐的不良反應(yīng)［3］。因此，如何減輕或者避免惡心嘔吐不良反應(yīng)成為開發(fā)PDE4抑制劑作為抗抑郁藥物的難點。格拉司瓊(granisetron，Gra)，為高選擇性 5－羥色胺 3(5－h(huán)ydroxytryptamine 3，5－HT3)受體拮抗劑，通過拮抗中樞化學(xué)感受區(qū)及外周迷走神經(jīng)末梢的5－HT3受體而抑制惡心嘔吐的發(fā)生［4］。

動物實驗中，常規(guī)用貓、狗和雪貂等評價嘔吐反應(yīng)。由于嚙齒類動物不具有嘔吐反射，Robichaud等［5］發(fā)現(xiàn)PDE4抑制劑部分通過模擬α2腎上腺素能受體拮抗劑的藥理作用而劑量依賴性地縮短氯胺酮/賽拉嗪誘導(dǎo)麻醉的大鼠翻正反射恢復(fù)時間，認(rèn)為這與PDE4抑制劑潛在致嘔吐作用有關(guān)，由此提出了專門用于嚙齒類動物評價PDE4潛在致嘔吐作用的一種新方法。此模型常用來評價新合成的PDE4抑制劑潛在致嘔吐反應(yīng)［5－6］:麻醉時間越長，PDE4抑制劑致嘔吐的潛能越小;時間越短，抑制劑致嘔吐的潛能越大。本研究采用該模型間接探討Rol合用Gra潛在致嘔吐作用，同時評價Gra對Rol抗抑郁、增強學(xué)習(xí)記憶能力效應(yīng)的影響。

1 材料與方法

1.1 動物、藥品、試劑及儀器

昆明小鼠，雄性，體質(zhì)量18～22 g，由南方醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心提供，合格證號:SCXK粵2006－0015。Gra、賽拉嗪(Sigma－Aldrich 公司);Rol(寧波市天衡制藥有限公司)，批號:090905;聚乙二醇200(PEG200)(阿拉丁試劑公司)，批號:26440;氯胺酮(福建古田藥業(yè)有限公司);草酸艾司西酞普蘭(escitalopram oxalate，ESC)(廣東佐森生物科技開發(fā)有限公司)，批號:20070403;Morris水迷宮，中國科學(xué)院藥物研究所。

1.2 Rol最佳致小鼠嘔吐反應(yīng)劑量的判定

昆明小鼠，分為4組，每組12只，即:麻醉對照組，Rol 0.05，0.5 和 5 mg·kg－1組。按照分組分別sc注射60%PEG200 或Rol 0.05，0.5 和5 mg·kg－115 min后，各組小鼠均單次ip注射按氯胺酮70 mg·kg－1和賽拉嗪 10 mg·kg－1的混合液。待小鼠翻正反射消失后，以仰臥位放置。記錄翻正反射持續(xù)消失時間。翻正反射恢復(fù)的判斷標(biāo)準(zhǔn)為:小鼠自主醒來不再仰臥，實驗者將其放回仰臥位后30 s內(nèi)自動翻回俯臥位，如此一共連續(xù)3次，即判斷為翻正反射恢復(fù)［3］。取時間最短的Rol劑量進行后續(xù)實驗。

1.3 觀察Gra對Rol致嘔吐反應(yīng)的影響

昆明小鼠，隨機分成6組，每組12只，即:麻醉對照組，Rol 0.5 mg·kg－1組，Gra 0.5 mg·kg－1和 Rol 0.5+Gra 0.05，0.5 和 5 mg·kg－1組。小鼠 ip 注射生理鹽水或Gra，45 min后，sc注射60%PEG200或Rol，15 min后，各組小鼠均單次 ip注射氯胺酮70 mg·kg－1和賽拉嗪 10 mg·kg－1的混合液，記錄翻正反射消失持續(xù)時間。

1.4 小鼠強迫游泳實驗

昆明小鼠，隨機分成6組，每組12只，即:正常對照組，Rol 0.5 mg·kg－1，Rol 0.5+Gra 0.05，0.5和 5 mg·kg－1組，陽性對照 ESC 10 mg·kg－1組。小鼠分別先 ip生理鹽水或 Gra，45 min后，sc注射60%PEG200或Rol或 ESC，45 min后，將小鼠單獨置于直徑12 cm，水深15 cm，水溫為25℃的圓形玻璃容器的水中，記錄小鼠在6 min內(nèi)后4 min的累計不動時間。

1.5 小鼠懸尾實驗

分組和給藥同1.4，將鼠尾(在距離尾尖1 cm處)夾住，使其呈倒立狀態(tài)，距離地面約40 cm，用塑料桶將其隔離起來。觀察記錄6 min內(nèi)后4 min小鼠累計不動時間。

1.6 Morris水迷宮實驗

分組同1.3，先ip注射Gra或生理鹽水，45 min后sc注射Rol或其溶劑，再過45 min后，開始Morris水迷宮訓(xùn)練，在直徑為120 cm、深度為50 cm，水溫為(23±2)℃的水池中，放置一個直徑為10 cm的平臺，水面高出平臺2 cm。人為地將水池平均劃分為四個象限，即分別為象限1，2，3，4，每個象限中固定一個點為入水點。將小鼠面向池壁放入水中，待小鼠找到平臺之后，讓其在平臺上停留20 s，如果小鼠在90 s內(nèi)未找到平臺，將其引至平臺停留20 s，每天4個位點入水，連續(xù)訓(xùn)練4 d，記錄第4天小鼠自入水點到登陸平臺的逃避潛伏期。第5天撤去平臺進行空間探索實驗，記錄小鼠90 s內(nèi)穿越原平臺次數(shù)及平臺所在象限探索時間比率。

1.7 統(tǒng)計學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 Rol對氯胺酮/塞拉嗪麻醉小鼠翻正反射消失持續(xù)時間的影響

表1結(jié)果顯示，不同劑量的Rol 0.05，0.5和5 mg·kg－1麻醉時間不同(F=3.462，P=0.024)。麻醉對照組小鼠平均需要49 min才恢復(fù)翻正反射，給予不同劑量的Rol后恢復(fù)翻正反射需要的時間均明顯縮短。依據(jù)本實驗結(jié)果，采用 Rol 0.5 mg·kg－1進行后續(xù)研究。

表1 咯利普蘭(Rol)對氯胺酮/塞拉嗪麻醉小鼠翻正反射消失持續(xù)時間的影響Tab.1 Effects of rolipram(Rol)on the duration of anesthesia induced by the combination of ketamine/xylazine in mice

2.2 Rol聯(lián)合Gra對氯胺酮/塞拉嗪麻醉小鼠翻正反射消失持續(xù)時間的影響

與麻醉對照組相比，單獨 Rol 0.5 mg·kg－1組翻正反射消失持續(xù)時間明顯縮短(P＜0.01)，聯(lián)合Gra 0.5 和5 mg·kg－1后，時間明顯延長(P ＜0.033)，而單獨使用Gra組的翻正反射消失持續(xù)時間與麻醉對照組接近(表2)。

2.3 Rol聯(lián)合Gra對小鼠游泳不動時間、懸尾不動時間的影響

與正常對照組相比，單獨注射Rol后小鼠強迫游泳實驗的不動時間明顯降低(P=0.031)，提示Rol具有抗抑郁活性。合用 Gra 0.05 ～0.5 mg·kg－1后，不動時間與單獨使用Rol組間無顯著差異(F=1.459，P=0.240)。ESC 0.5 mg·kg－1組小鼠不動時間明顯短于正常對照組，與各用藥組相當(dāng)。提示小鼠強迫游泳實驗中Rol能顯著降低小鼠游泳不動時間，而Gra對其無影響(表3)。與懸尾實驗中正常對照組小鼠不動時間相比，單獨給予Rol后小鼠的不動時間明顯降低(P=0.038);若先注射Gra 0.05～0.5 mg·kg－1后給予 Rol，各組的不動時間與單獨使用 Rol比較無顯著差異。ESC 0.5 mg·kg－1組小鼠不動時間明顯短于正常對照組，與各用藥組相當(dāng)。提示小鼠懸尾實驗中單獨使用Rol能顯著降低小鼠懸尾不動時間，而Gra并不影響Rol縮短懸尾不動時間的效應(yīng)(表3)。

表2 Rol與格拉司瓊(Gra)合用對氯胺酮/塞拉嗪麻醉小鼠翻正反射消失持續(xù)時間的影響Tab.2 Effects of Rol combined with granisetron(Gra)on the duration of anesthesia induced by the combination of ketamine/xylazine in mice

表3 Rol與Gra合用對強迫游泳和懸尾實驗中小鼠累計不動時間的影響Tab.3 Effects of the combination of Rol and Gra on immobility time in forced swimming and tail suspension test in mice

2.4 Gra對Rol增強空間記憶能力的影響

經(jīng)過4 d尋找隱藏平臺訓(xùn)練，各組小鼠的逃避潛伏期均迅速下降。重復(fù)測量的方差分析顯示，從第2天開始，每天均較前一天進步(P＜0.05)。在第4天，與正常對照組比較，單獨使用Rol組、Gra和Rol合用組均顯著降低小鼠第4天自入水點至平臺的逃避潛伏(P＜0.05)，單獨Gra不影響小鼠的逃避潛伏期(P=0.409)。單獨使用Rol組和聯(lián)合使用Gra各組之間無顯著差異(F=0.038，P=0.990)，提示Gra對Rol縮短小鼠逃避潛伏期的能力無影響(表4)。

表5結(jié)果顯示，正常對照組小鼠在撤去平臺后穿越原平臺次數(shù)平均為(1.7±1.1)次，單獨給予Gra以及聯(lián)合 Rol 0.05 mg·kg－1處理后，穿越平臺次數(shù)組無顯著增加，其余各組穿越平臺次數(shù)明顯增多(P＜0.05)。同樣的趨勢表現(xiàn)在原平臺象限探索時間的比率上。僅注射Rol后的平均比率從正常對照組的(31±12)%上升到(41±10)%(P=0.007)，合用Gra不影響Rol對探索時間比率的增加(F=0.153，P=0.927)。Morris水迷宮實驗結(jié)果提示Gra不影響Rol的改善空間學(xué)習(xí)記憶的能力。

表4 Rol與Gra合用對Morris水迷宮中小鼠逃避潛伏期的影響Tab.4 Effects of the combination of Rol and Gra on escape latency

表5 Rol與Gra合用對Morris水迷宮中小鼠穿越原平臺次數(shù)和原平臺象限探索時間的比率的影響Tab.5 Effects of the combination of Rol and Gra on the number of crossings and time spent in the target quadrant in Morris water maze in mice

3 討論

本實驗采用昆明小鼠來間接評價Rol潛在惡心嘔吐反應(yīng)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)不同劑量的Rol均縮短小鼠的麻醉時間，劑量為 0.5 mg·kg－1時，小鼠翻正反射恢復(fù)需要的時間最短，而且該劑量的Rol有較好的抗抑郁和改善空間學(xué)習(xí)認(rèn)知效應(yīng)，此外，0.5 mg·kg－1尚不足以引起小鼠自主活動抑制［7］，因此，在后續(xù)實驗中用 Rol 0.5 mg·kg－1作為最終劑量。

Rol+Gra 0.05，0.5 和 0.5 mg·kg－1組相對于單獨的Rol組的小鼠的翻正反射恢復(fù)需要的時間延長，但是并沒到達麻醉對照組的水平。這可能由于PDE4抑制劑不僅通過α2受體途徑，同時神經(jīng)激肽1受體，5－HT等受體也參與調(diào)節(jié)惡心嘔吐反應(yīng)［8－9］。Rol合用 Gra 后，阻斷 5－HT3受體，而 α2腎上腺素能受體和神經(jīng)激肽1受體未被阻斷，所以表現(xiàn)為麻醉時間有一定延長，但是尚未達到麻醉對照組的水平。Robichaud等［10］用雪貂進行嘔吐實驗也證實了5－HT3拮抗劑昂丹司瓊可以部分逆轉(zhuǎn)PDE4抑制劑誘導(dǎo)的嘔吐反射次數(shù)，和本實驗吻合，提示5－HT3也參與了調(diào)節(jié)PDE4抑制劑引起的嘔吐反應(yīng)。

在小鼠懸尾實驗中，Rol聯(lián)合Gra后，抗抑郁活性增強，提示Gra與Rol可能有協(xié)同增效的作用，在小鼠強迫游泳實驗中，出現(xiàn)類似的趨勢。遺憾的是，在抗抑郁評價實驗中，因為小鼠數(shù)量不夠，沒有用單獨的Gra進行實驗，所以不能驗證Gra本身是否具有一定的抗抑郁作用。

此外，一些文獻報道，5－HT3抑制劑具有抗抑郁、減輕焦慮、減少惡心、增強記憶的功能，但其效果和作用機制尚不明確。有人認(rèn)為抗抑郁作用與突觸前 5－HT3A和突觸后 5－HT3B有關(guān)［8］，在研究嗅覺的學(xué)習(xí)記憶功能時［11］，發(fā)現(xiàn)嗅球的5－HT通過細胞外信號調(diào)節(jié)激酶(ERK)和CREB結(jié)合蛋白途徑調(diào)節(jié)嗅覺學(xué)習(xí)記憶功能，5－HT3抑制劑是否也通過ERK和CREB結(jié)合蛋白途徑產(chǎn)生抗抑郁、提高學(xué)習(xí)記憶能力的作用尚不明確，有待進一步研究。

Rol+Gra 0.05，0.5 和 0.5 mg·kg－1組和單獨Rol組小鼠的逃避潛伏期、穿越原平臺次數(shù)及原平臺象限探索時間比率無統(tǒng)計學(xué)差異，提示Gra不影響Rol提高空間學(xué)習(xí)記憶功能的能力。本課題組前期的研究中發(fā)現(xiàn)，無論是在正常動物還是認(rèn)知障礙動物模型上，Rol均可顯著改善認(rèn)知、增強記憶。采用基因敲除手段確認(rèn)了PDE4D亞型是與學(xué)習(xí)記憶關(guān)系較密切的一個亞型。此外，用RNA干擾技術(shù)證明，PDE4D4/5亞型參與阿爾茨海默病的記憶調(diào)節(jié)，下調(diào)PDE4的兩種亞亞型PDE4D4/5基因表達緩解淀粉樣β蛋白造成的空間記憶損傷，這兩種亞型可能在海馬依賴型記憶形成和鞏固中起重要作用。Rol目前改善學(xué)習(xí)記憶的功能逐漸受到普遍認(rèn)可，常用作陽性對照藥或工具藥［12－13］。

本實驗從藥效學(xué)上初步探討了Rol聯(lián)合Gra用藥的效果，結(jié)果顯示Gra能夠減少Rol所致的惡心嘔吐不良反應(yīng)，與此同時并不影響Rol的抗抑郁、增強學(xué)習(xí)記憶能力的效應(yīng)。但是還有諸多問題亟待解決，例如抗抑郁作用還需要慢性長期考察，聯(lián)合用藥后新的不良反應(yīng)、給藥劑量和配伍，兩藥相互作用規(guī)律，兩藥藥代動力學(xué)差異，劑型設(shè)計等，有望在進一步的實驗研究中明確Gra聯(lián)合Rol治療抑郁癥、改善學(xué)習(xí)記憶的應(yīng)用前景。

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