朱曉燕

（哈藥集團(tuán)三精制藥股份有限公司，黑龍江 哈爾濱 150000）

微生物限度檢查法

取銀杏葉口服液3支（規(guī)格：10ml）,共取10ml供試品，至90mlPH7.0氯化鈉-蛋白胨緩沖液中，混勻，制成 1：10、1：100、1：1000 供試液備用。

細(xì)菌數(shù) 取1：10供試液50ml用薄膜過(guò)濾法過(guò)濾。用PH7.0無(wú)菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液沖洗濾膜,每次沖洗100ml,共沖洗三次.沖洗后取出濾膜,菌面朝上貼于營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基平板上培養(yǎng).若濾膜上無(wú)菌落生長(zhǎng),以<1乘以稀釋倍數(shù)報(bào)告菌數(shù).

霉菌數(shù) 取各稀釋級(jí)供試液1ml，采用平皿法，依法《中國(guó)藥典》2005年版一部附錄檢查，應(yīng)符合規(guī)定。

控制菌取1：10供試液10ml（相當(dāng)于供試品1ml）接種至100 ml相應(yīng)培養(yǎng)基中，培養(yǎng)18-24小時(shí)。依《中國(guó)藥典》2005年版一部附錄檢驗(yàn)，結(jié)果應(yīng)符合規(guī)定。

微生物限度檢查方法學(xué)驗(yàn)證

依據(jù)《中國(guó)藥典》2005年版，對(duì)銀杏葉口服液的微生物限度檢查法進(jìn)行了方法學(xué)驗(yàn)證，驗(yàn)證結(jié)果如下：

1 樣品：銀杏葉口服液

批號(hào)：10042114、10042124、10042134

生產(chǎn)單位：哈藥集團(tuán)三精制藥股份有限公司

2 驗(yàn)證用菌種：

金黃色葡萄球菌 (Staphylococcus aureus)[CMCC(B)26003]

大腸埃希菌（Escherichia coli）[CMCC(B)44102]

枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）[CMCC(B)63501]

白色念珠菌 (Candida albicans)[CMCC(F)98001]

黑曲霉(Aspergillus niger)[CMCC(F)98003]

3 驗(yàn)證用培養(yǎng)基：

營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基 批號(hào)：090225

玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)基 批號(hào)：080905

膽鹽乳糖培養(yǎng)基 批號(hào)：090104

營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基 批號(hào)：090121

改良馬丁培養(yǎng)基 批號(hào)：090220

曙紅亞甲藍(lán)培養(yǎng)基 批號(hào)：090322

以上培養(yǎng)基均由中檢所提供。

4 菌液制備：

4.1 接種大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌的新鮮培養(yǎng)物至營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中，培養(yǎng)18-24小時(shí)；

接種白色念珠菌至改良馬丁培養(yǎng)基中，培養(yǎng)24-48小時(shí)。

以上菌液用0.9%無(wú)菌氯化鈉溶液稀釋成50-100CFU/ml的菌懸液，并同時(shí)進(jìn)行活菌計(jì)數(shù)。

4.2 接種黑曲霉至改良馬丁瓊脂斜面培養(yǎng)基中，培養(yǎng)5-7天。用氯化鈉溶液3-5ml將黑曲霉孢子洗脫至無(wú)菌試管內(nèi)，再用氯化鈉溶液制成50-100CFU/ml的孢子懸液，并同時(shí)進(jìn)行活菌計(jì)數(shù)。

5 供試液制備：

取銀杏葉口服液3支，共取供試品10ml，至90mlPH7.0氯化鈉-蛋白胨緩沖液中，混勻，制成1：10的供試液備用。(共制3份該供試液，分別供3種細(xì)菌試驗(yàn)用)

6 方法學(xué)驗(yàn)證試驗(yàn)：

6.1 細(xì)菌計(jì)數(shù)方法驗(yàn)證：

6.1.1 試驗(yàn)組：

取1:10的供試液50ml用薄膜過(guò)濾法過(guò)濾。用PH7.0無(wú)菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液沖洗濾膜，每次沖洗100ml，共沖洗三次.在最后一次沖洗液中加入50-100cfu/ml試驗(yàn)菌1ml，沖洗后取出濾膜，菌面朝上貼于營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基平板上培養(yǎng)，測(cè)定試驗(yàn)組菌數(shù)。

6.1.2 菌液組：

取上述菌液1ml至平皿中，傾注營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基，至相應(yīng)的溫度培養(yǎng)。測(cè)定所加的試驗(yàn)菌數(shù)。

6.1.3 供試品對(duì)照組：

取規(guī)定量供試液，按菌落計(jì)數(shù)方法測(cè)定供試品本底菌數(shù)。

6.1.4 稀釋劑對(duì)照組：

用相應(yīng)稀釋劑和沖洗液代替供試品，按試驗(yàn)組的方法測(cè)定其菌數(shù)。

6.2 霉菌及酵母菌計(jì)數(shù)方法驗(yàn)證：

6.2.1 試驗(yàn)組：

取1：10供試液1ml于平皿中，再加入相應(yīng)的陽(yáng)性試驗(yàn)菌菌液1ml，立即傾注玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)基，置相應(yīng)溫度培養(yǎng)，每株試驗(yàn)菌平行制備二個(gè)平皿，測(cè)定其菌數(shù)。

6.2.2 菌液組：

取稀釋好的相應(yīng)菌液1ml，方法同試驗(yàn)組，分別加入平皿中，加入相應(yīng)培養(yǎng)基，置相應(yīng)溫度培養(yǎng)，測(cè)定所加的試驗(yàn)菌數(shù)。

6.2.3 供試品對(duì)照組：

取規(guī)定量供試液，按菌落計(jì)數(shù)法測(cè)定供試品本底菌數(shù)。

6.2.4 稀釋劑對(duì)照組：

取稀釋劑替代供試液，方法同試驗(yàn)組。

7 次驗(yàn)證結(jié)果見(jiàn)表1，2，3

7.1 控制菌檢查方法驗(yàn)證：

7.1.1 大腸埃希菌檢查方法驗(yàn)證

菌種：

陽(yáng)性菌：大腸埃希菌（Escherichia coli）[CMCC(B)44102]

陰性菌：金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)[CMCC(B)26003]

試驗(yàn)方法：

7.1.2 試驗(yàn)組：取1：10供試液10ml（相當(dāng)于供試品1ml）及10-100cfu試驗(yàn)菌接種至膽鹽乳糖培養(yǎng)基100 ml中，培養(yǎng)18-24小時(shí)。依《中國(guó)藥典》2005年版一部附錄檢驗(yàn)。

7.1.3 陰性對(duì)照組：方法同試驗(yàn)組，加入1ml 10-100cfu陰性菌。

8 次驗(yàn)證結(jié)果見(jiàn)表4，5，6

8.1 結(jié)果：

8.1.1 計(jì)數(shù)方法驗(yàn)證：在三次獨(dú)立的平行試驗(yàn)中，稀釋劑對(duì)照組的菌回收率均大于70%，試驗(yàn)組的菌回收率均大于70%。故可照該供試液制備法和計(jì)數(shù)法，測(cè)定銀杏葉口服液的細(xì)菌數(shù)、霉菌數(shù)及酵母菌數(shù)。

a.制菌檢查法驗(yàn)證：陰性對(duì)照組未檢出陰性對(duì)照菌，試驗(yàn)組檢出陽(yáng)性試驗(yàn)菌，故可以照此供試液制備法和控制菌檢查法進(jìn)行銀杏葉口服液的控制菌檢查。

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[1]宋勤,杜平華.中成藥微生物限度檢查方法的探討[J].中國(guó)藥事，2006-01-20.