仇鳳梅，楊 波，李 娜，張如松

（浙江中醫(yī)藥大學(xué) 藥學(xué)院，浙江 杭州 310053）

異葉敗醬（Patrinia sp.）為敗醬科敗醬屬多年生草本植物，藥用其根［1］，有消腫排膿、祛瘀止痛的功效，臨床上用于治療急性闌尾炎初起、瘰疬、無名腫痛、宮頸糜爛、跌打損傷、骨折等癥［2］?，F(xiàn)代藥理研究表明［3－4］，異葉敗醬不同提取物對體內(nèi)外腫瘤癌細(xì)胞有強(qiáng)殺傷作用，但未見報(bào)到其對B16和C6腫瘤細(xì)胞的作用。我們從異葉敗醤中分離純化得到抗腫瘤的有效部位PHEB，通過體外抗腫瘤實(shí)驗(yàn)，明確PHEB對B16和C6腫瘤細(xì)胞的抑制作用。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 細(xì)胞株及培養(yǎng)條件

C6細(xì)胞由浙江省醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥物研究所提供；B－16細(xì)胞由浙江中醫(yī)藥大學(xué)資源鑒定實(shí)驗(yàn)室提供。B－16細(xì)胞接種于RPMI－1640培養(yǎng)基中；C6細(xì)胞接種于DMEM培養(yǎng)基中；兩者均于37℃、5%CO2、飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，細(xì)胞長滿瓶底近80%后用PBS清洗，以0.25%胰酶消化3～5min，轉(zhuǎn)移至離心管，1000rpm離心3min，棄上清液，適量培養(yǎng)基混懸吹打成單細(xì)胞懸液進(jìn)行傳代。加藥均在細(xì)胞對數(shù)生長期內(nèi)進(jìn)行。

1.2 藥物

PHEB，由本實(shí)驗(yàn)制備，用DMSO配制為10g／L的貯存液，實(shí)驗(yàn)前用RPMI－1640培養(yǎng)基稀釋至所需濃度；RPMI－1640培養(yǎng)基：554362，Invitrogen公司。新生小牛血清：080304，杭州四季青生物工程材料研究；0.25%胰蛋白酶：1299A77，上海生工公司，進(jìn)口分裝；DMEM 培養(yǎng)基：397753，Invitrogen公司；MTT（四甲基偶氮唑鹽）：3154B79，杭州昊天生物技術(shù)有限公司，進(jìn)口分裝。

1.3 儀器

Thermo Forma 991超低溫冰箱，美國Thermo電子公司；Thermo Forma 3111細(xì)胞（CO2）培養(yǎng)箱，美國 Bio－Tech公司；Air Tech超凈工作臺，蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司；OLYMPUS CKX41SF倒置生物顯微鏡，日本Olympus公司；BIO－RAD 680酶標(biāo)儀，日本BIO－RAD公司。

2 方法

2.1 PHEB的制備

取異葉敗醬干燥根莖19.5kg，粉碎成粗粉，加80%乙醇浸泡48h后，裝入滲漉缸，收集滲漉液，滲漉液回收乙醇至無醇味，得到浸膏。浸膏加適量乙酸乙酯萃取3次，收集萃取液并回收溶劑，得到乙酸乙酯提取物（PHE）1040g。取250g乙酸乙酯提取物，進(jìn)行硅膠柱層析分離，用不同濃度比例二氯甲烷－乙酸乙酯梯度洗脫，分離得到4個流分PHE（A、B、C、D）。其中二氯甲烷－乙酸乙酯（10∶1）50L洗脫后，得到18.8g黃色油狀物質(zhì)（PHEB）。

2.2 PHEB體外抗腫瘤實(shí)驗(yàn)

取對數(shù)生長期的B－16和C6細(xì)胞，0.25%胰蛋白酶消化，轉(zhuǎn)移至離心管離心，棄上清液，加入新的適量RPMI1640或DMEM培養(yǎng)基吹成單細(xì)胞懸液；根據(jù)不同細(xì)胞生長速度，以適宜的細(xì)胞數(shù)接種于96孔板上，置于CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h。然后分別加入5組濃度呈等比遞減的PHEB（最大給藥濃度60μg／mL）。設(shè)正常對照組（加腫瘤細(xì)胞，不加PHEB）和空白孔（不加腫瘤細(xì)胞和PHEB），使每孔總體積為200μL，各設(shè)3個復(fù)孔。繼續(xù)在CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)72h后，倒置顯微鏡下觀察不同濃度的PHEB對腫瘤細(xì)胞的影響；加入MTT繼續(xù)培養(yǎng)至少4h后，棄去孔內(nèi)培養(yǎng)上清液，加入DMSO溶解，震蕩混勻后，在酶標(biāo)儀上570nm波長處測定OD值，作為存活細(xì)胞個數(shù)的相對值。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。用82798－IC50計(jì)算軟件計(jì)算IC50，并計(jì)算95%可信限區(qū)間。

按下列公式計(jì)算抑瘤率：

3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)

4 結(jié)果

從異葉敗醤醇提物中分離精制得到PHEB（4.0‰）。結(jié)果表明，PHEB對B－16和C6腫瘤細(xì)胞均有一定的抑制作用（詳見表1），且抑制率都隨著給藥濃度的增大而增強(qiáng)，具有明顯的量－效關(guān)系（詳見圖1）。

表1 PHEB作用72h對腫瘤細(xì)胞的抑制作用（，n＝3）

表1 PHEB作用72h對腫瘤細(xì)胞的抑制作用（，n＝3）

瘤株 IC50（μg／mL） 95%可信限區(qū)間（μg／mL）B－16 33.5±3.70 24.53，43.87 C6 41.2±3.50 32.71，50.29

5 討論

惡性腫瘤（以下簡稱腫瘤）是嚴(yán)重威脅人類健康的一類常見疾病，其死亡率僅次于心腦血管疾病。因此，尋找有效新藥仍然是急需解決的問題。中藥作為抗腫瘤藥，具有有效成分種類多、抗瘤譜廣、副作用小等特點(diǎn)。為尋找中藥異葉敗醬抗腫瘤作用有效成分，本實(shí)驗(yàn)采用MTT法考察發(fā)現(xiàn)PHEB對B－16和C6腫瘤細(xì)胞均具有一定的細(xì)胞毒作用，且具有一定量－效關(guān)系。通過研究，將進(jìn)一步豐富異葉敗醬抗腫瘤譜，且為研究異葉敗醬抗腫瘤有效成分打下基礎(chǔ)。

圖1 不同濃度PHEB作用72h后對B－16和C6腫瘤細(xì)胞生長的抑制作用

［1］江蘇新醫(yī)學(xué)院.中藥大辭典［M］.上海：上海人民出版社，1977：2445－2446.

［2］南京中醫(yī)藥大學(xué).中藥大辭典（下冊）［M］.上海：上?？茖W(xué)技術(shù)出版社，2006：3405.

［3］耿果霞，陸文總，李青旺，等.異葉敗醬多糖的體內(nèi)抗腫瘤活性研究［J］.西北農(nóng)林科技大學(xué)學(xué)報(bào)：自然科學(xué)版，2010，38（11）：14－18.

［4］程衛(wèi)東，李立.墓頭回的研究進(jìn)展［J］.甘肅中醫(yī)，2006，19（10）：39－41.