楊雯靖 張雪鵬 焦桂梅 趙光明 路延芹 胡寶山

乳腺癌是女性最常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，其侵襲與轉(zhuǎn)移的生物學(xué)特征是導(dǎo)致乳腺癌復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移及患者死亡的主要原因[1]。乳腺癌為激素依賴性腫瘤，內(nèi)源性激素在乳腺癌的發(fā)生發(fā)展中起著重要的作用。解聚素-金屬蛋白酶（adisintegrin and metallo?protease，ADAM）是近年來(lái)發(fā)現(xiàn)的一類細(xì)胞膜表面糖蛋白家族，具有多種功能，最新研究表明其與腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移密切相關(guān)[2]。ADAM17是ADAM家族成員之一，又名腫瘤壞死因子（TNF）-ɑ轉(zhuǎn)化酶（TACE），可以通過(guò)降解細(xì)胞基底膜和細(xì)胞外基質(zhì)及影響組織的重塑促進(jìn)腫瘤的局部浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移。ADAM17在多種腫瘤組織中均呈高表達(dá)[3-4]。本研究通過(guò)RNA干擾（RNAi）技術(shù)封閉人乳腺癌細(xì)胞內(nèi)ADAM17的表達(dá)，觀察其對(duì)癌細(xì)胞體外侵襲能力的影響，為腫瘤治療提供新的方法。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞及細(xì)胞培養(yǎng) 人MCF-7乳腺癌細(xì)胞株購(gòu)自中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院血液學(xué)研究所，置于37℃、5%CO2孵箱中常規(guī)培養(yǎng)。

1.2 主要試劑 Lipofectamine 2000、Trizol、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購(gòu)自Invitrogen公司；實(shí)時(shí)聚合酶鏈反應(yīng)（real-time PCR）試劑盒購(gòu)自Promega公司；Transwell小室、Matrigel購(gòu)自BD公司。質(zhì)粒siRNA由上海吉瑪公司化學(xué)合成，針對(duì)ADAM17的小干擾RNA（ADAM17-small interference RNA，ADAM17-siRNA），序列為5′-TGAGGCAGTCTCTCCTATTCCTGACCAGC-3′，干擾的無(wú)義序列RNA的序列為5′-TGACCACCCTGACCTACGGC GTGCAGTGC-3′。兔抗人ADAM17多克隆抗體購(gòu)自美國(guó)Ad?cam公司，兔抗人β-actin、DAB顯色劑購(gòu)自武漢博士德生物工程有限公司。

1.3 siRNA的轉(zhuǎn)染及實(shí)驗(yàn)分組 細(xì)胞生長(zhǎng)至80%融合時(shí)，無(wú)血清改良的依格爾培養(yǎng)基（Dulbecco’s modified Eagle’s medi?um，DMEM）培養(yǎng)液培養(yǎng)1 h。采用脂質(zhì)體Lipofectamine 2000介導(dǎo)，按產(chǎn)品說(shuō)明書操作。實(shí)驗(yàn)分為3組，每組設(shè)2個(gè)復(fù)孔，平行實(shí)驗(yàn)3次。（1）乳癌組：加入1 mL的磷酸鹽緩沖液（PBS）。（2）轉(zhuǎn)染對(duì)照組：加入等量干擾的無(wú)義序列siRNA。（3）ADAM17-siRNA組（轉(zhuǎn)染組）：加入等量的ADAM17-siR?NA?；蜣D(zhuǎn)染6 h后更換為含10%胎牛血清（FBS）的DMEM培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)。

1.4 real-time PCR檢測(cè)ADAM17 mRNA的表達(dá) 轉(zhuǎn)染48 h后，每組取2個(gè)復(fù)孔，平行實(shí)驗(yàn)3次。Trizol法提取細(xì)胞總RNA，逆轉(zhuǎn)錄后行real-time PCR。ADAM17引物序列上游：5′-ATCAAACCCTTTCCTGCG-3′，下游：5′-CAAACCCATCCT CGTCCA-3′，擴(kuò)增片段長(zhǎng)度154 bp。β-actin上游：5′-CTGGA ACGGTGAAGGTGACA-3′，下游：5′-AAGGGACTTCCTGTAA CAATGCA-3′，擴(kuò)增片段長(zhǎng)度為165 bp。PCR的反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性5 min，95℃ 20 s、58℃ 30 s、72℃ 30 s，共40個(gè)循環(huán)，72℃延伸10 min。電腦分析基因的擴(kuò)增情況，導(dǎo)出相應(yīng)的域值循環(huán)數(shù)，并以β-actin的表達(dá)作為內(nèi)參，計(jì)算基因的相對(duì)表達(dá)量。各組ADAM17的Ct值均經(jīng)β-actin校正，以正常組的表達(dá)作為100%。

1.5 Western blot檢測(cè)ADAM17蛋白的表達(dá) 轉(zhuǎn)染48 h后，細(xì)胞裂解液[50 mmol/L Tris pH 8.0，150 mmol/L NaCl，1%乙基苯基聚乙二醇（NP-40），0.1%十二烷基硫酸鈉（SDS），0.5% 溶解有機(jī)碳（DOC），2 mmol/L乙二胺四乙酸（EDTA），1 mmol/L苯甲基磺酰氟（PMSF），10 μmol/L亮抑酶肽（leupeptin），1 μmol/L胃酶抑素A（pepstatin A），1 g/L胰蛋白酶抑制劑（apro?tinin）]裂解細(xì)胞，冰浴 30 min后,低溫離心10 min，收集上清。考馬斯亮藍(lán)染色檢測(cè)總蛋白濃度后，取50 μg總蛋白按常規(guī)方法進(jìn)行7.5%SDS-PAGE電泳并轉(zhuǎn)膜，根據(jù)Marker定位保留含目的條帶區(qū)域的硝酸纖維素膜并用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.05的脫脂奶粉室溫下封閉1 h，加入封閉液稀釋的抗ADAM17或β-actin的Ⅰ抗，4℃過(guò)夜。次日漂洗3次后，加入稀釋后的Ⅱ抗，室溫放置1 h。漂洗3次，加入DAB顯色。共行3次Western blot實(shí)驗(yàn)。ADAM17蛋白在110 ku處顯示特異性條帶，設(shè)分子質(zhì)量為42 ku的β-actin為內(nèi)參。圖片分析儀掃描后，Quantity one軟件分析。

1.6 體外侵襲實(shí)驗(yàn) 采用Transwell小室實(shí)驗(yàn)方法，制備趨化因子。當(dāng)細(xì)胞至90%融合時(shí)，無(wú)血清DMEM培養(yǎng)48 h，收集培養(yǎng)液，低溫離心取上清，-20℃保存?zhèn)溆?。制備Transwell小室，Matrigel用預(yù)冷的無(wú)血清DMEM按照2∶1的比例稀釋后滴加在Transwell上室的聚碳酸酯膜上，37℃放置30 min，使Matrigel聚合成凝膠。隨后將轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞（5×105/mL，100 μL）滴加到上層小室，在下室中加入按1∶1混合的趨化因子和完全培養(yǎng)基500 μL，5%CO237℃條件下培養(yǎng)24 h，經(jīng)HE染色后顯微鏡下（×100）觀察穿過(guò)Transwell小室的細(xì)胞數(shù)量，作為評(píng)價(jià)侵襲能力的指標(biāo)。每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔，平行實(shí)驗(yàn)2次。每張切片隨機(jī)計(jì)數(shù)8個(gè)視野的細(xì)胞數(shù)，計(jì)算平均值。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 數(shù)據(jù)分析采用SPSS 17.0軟件，正態(tài)分布資料用x ±s表示，應(yīng)用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD法。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 ADAM17 mRNA的表達(dá) ADAM17 mRNA在乳癌組中高表達(dá)，轉(zhuǎn)染對(duì)照組能降低這種表達(dá)，但轉(zhuǎn)染組可明顯抑制ADAM17 mRNA的表達(dá)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），見(jiàn)表1。

2.2 ADAM17蛋白的表達(dá) ADAM17在乳癌組中高表達(dá)，轉(zhuǎn)染對(duì)照組不能降低這種表達(dá)，但轉(zhuǎn)染組卻可抑制ADAM17的表達(dá)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01），見(jiàn)圖1、表1。

表1 人MCF-7乳腺癌細(xì)胞中ADAM17 mRNA的表達(dá)（x ±s）

圖1 Western blot檢測(cè)ADAM17-siRNA作用下人MCF-7乳腺癌細(xì)胞表達(dá)ADAM17蛋白的情況

2.3 腫瘤細(xì)胞體外侵襲能力的檢測(cè) 乳癌組的腫瘤細(xì)胞可明顯穿過(guò)人工基底膜到達(dá)下室。轉(zhuǎn)染對(duì)照組到達(dá)下室的細(xì)胞數(shù)量與乳癌組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。但轉(zhuǎn)染組穿過(guò)人工基底膜到達(dá)下室的乳腺癌細(xì)胞數(shù)量明顯減少，與乳癌組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01），見(jiàn)圖2、表1。

3 討論

圖2 Transwell小室實(shí)驗(yàn)檢測(cè)ADAM17-siRNA作用下人MCF-7乳腺癌細(xì)胞穿透濾膜的情況（HE×100）

近年，我國(guó)乳腺癌發(fā)病率呈上升趨勢(shì)，已經(jīng)成為女性死亡的第2位病因[5]。侵襲和轉(zhuǎn)移是造成乳腺癌患者最終死亡的主要原因。目前雖通過(guò)早發(fā)現(xiàn)、早診斷及早治療等原則使乳腺癌患者的生存率有所提高，但結(jié)果仍不盡人意。因此，探討乳腺癌侵襲和轉(zhuǎn)移等預(yù)后指標(biāo)的生物學(xué)標(biāo)志物是目前乳腺癌研究的主要方向。在腫瘤的浸潤(rùn)、轉(zhuǎn)移過(guò)程中，細(xì)胞外基質(zhì)（extracellular matrix，ECM）的降解是最重要的條件，而ECM的降解主要依靠各種蛋白水解酶，其中基質(zhì)金屬蛋白酶（MMPs）是基質(zhì)降解代謝的主要酶類。MMPs幾乎能降解細(xì)胞外基質(zhì)中的各種蛋白成分，破壞腫瘤細(xì)胞侵襲的組織學(xué)屏障，在腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移中起關(guān)鍵性作用，被認(rèn)為是該過(guò)程中主要的蛋白水解酶[6]。ADAM17屬于MMPs，可以降解細(xì)胞基底膜和細(xì)胞外基質(zhì)，因而在腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移中發(fā)揮重要作用。

有研究顯示ADAM17在正常乳腺組織中少量或不表達(dá)，在乳腺纖維瘤組織中表達(dá)有所增強(qiáng)，而在人乳腺癌組織中表達(dá)明顯增高[7]。因此通過(guò)不同的手段抑制ADAM17的表達(dá)可以降低腫瘤細(xì)胞的惡性表達(dá)，其中RNAi是一項(xiàng)有效的基因沉默新技術(shù)。與傳統(tǒng)的基因治療相比，因其具有高度的特異性和很高的效率，可使腫瘤治療的針對(duì)性更強(qiáng)、不良反應(yīng)更小。尤其是siRNA干涉載體的出現(xiàn)，可有效干涉目的基因的表達(dá)[8]，可與其靶mRNA的3′非翻譯區(qū)特異性結(jié)合，引起靶mRNA的翻譯抑制或降解，在細(xì)胞的生長(zhǎng)、分化等過(guò)程中發(fā)揮癌基因或抑癌基因的作用，從而為乳腺癌致病基因研究提供了新的途徑[9]，這些干涉載體的出現(xiàn)可以大大降低使用成本、提高轉(zhuǎn)染效率，從而極大地促進(jìn)了RNAi的應(yīng)用。

本實(shí)驗(yàn)采用化學(xué)合成的siRNA干擾片段轉(zhuǎn)染乳腺癌細(xì)胞，進(jìn)而觀察腫瘤細(xì)胞的體外侵襲能力。Re?al-time PCR檢測(cè)顯示轉(zhuǎn)染組細(xì)胞的ADAM17表達(dá)量顯著降低，說(shuō)明針對(duì)ADAM17的siRNA可以有效地抑制ADAM17mRNA的表達(dá)，而且Western blot檢測(cè)ADAM17蛋白的表達(dá)也明顯下降，說(shuō)明特異性的ADAM17-siRNA可以通過(guò)抑制ADAM17mRNA的表達(dá)來(lái)抑制其蛋白的表達(dá)，從而抑制ADAM17蛋白的生物學(xué)功能。本研究體外侵襲實(shí)驗(yàn)顯示轉(zhuǎn)染組細(xì)胞的穿膜數(shù)與乳癌組和轉(zhuǎn)染對(duì)照組相比顯著降低，表明ADAM17的表達(dá)受抑制后可降低腫瘤細(xì)胞降解細(xì)胞外基質(zhì)的能力，從而抑制腫瘤細(xì)胞的侵襲能力。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明ADAM17在人乳腺癌細(xì)胞的侵襲中具有重要的促進(jìn)作用，以此為靶點(diǎn)可作為乳腺癌基因治療的一個(gè)新方向。

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