班媛媛 李道勝 李曉梅 龐 宇 葉 紅

肺癌為當前世界病死率最高的惡性腫瘤，其中非小細胞肺癌所占比例高達85%。微小染色體維持蛋白(minichromosomemaintenance proteins，MCM)家族，是一組與DNA復制和細胞增生密切相關的蛋白家族，許多研究發(fā)現(xiàn)它的mRNA水平在細胞周期中呈周期性變化，只在增殖細胞中表達，在靜止細胞中不表達，而且每個細胞周期只表達一次。它的檢測水平的增高不但標志著惡性細胞的增殖，而且標志著非典型細胞的增生和潛在癌性細胞的增生。因此，MCM可以作為腫瘤有效標志物的候選因子。我們應用免疫組化方法，對非小細胞肺癌石蠟包埋組織標本中的MCM5進行檢測，觀察其在病變組織中的表達，探討了其與NSCLC臨床病理特征的關系。

1 材料與方法

1.1 標本收集

收集泰安市中心醫(yī)院2008年～2010年收治的、經病理檢查確診的非小細胞肺癌石蠟包埋存檔組織78例，其中男性50例，女性28例。年齡36～80歲。組織學分類:鱗狀細胞癌46例，腺癌32例，其中高分化19例，中分化39例，低分化20例。78例中無淋巴結轉移者29例，有淋巴結轉移者49例;根據(jù)2002年國際抗癌聯(lián)盟TNM分期:Ⅰ期20例，Ⅱ期27例，Ⅲ期31例。所有患者術前均未經放療及化療，癌旁正常肺組織標本40例。

1.2 免疫組化法

每一病例蠟塊連續(xù)切片1張，厚5μm。MCM5購自北京中杉金橋生物公司，染色均采用免疫組化SP法，用微波修復抗原。MCM5染色用從生物公司購買的陽性片作為陽性對照，以封閉血清代替一抗作為陰性對照。

1.3 結果判定

MCM5免疫反應陽性產物主要定位于細胞核，陽性物質呈黃色顆粒狀，染色強時可呈棕褐色。采用Greenspan半定量法［1］對細胞染色強度及陽性細胞百分率進行評分。①根據(jù)每張切片中細胞染色強度評分:細胞內無染色為0分;淺黃色為1分;棕黃色為2分;棕褐色為3分。②按組織切片中的陽性染色細胞數(shù)占全部腫瘤細胞百分比記分(隨機取10個高倍鏡視野的平均數(shù)):陽性細胞率為0，記0分，＜10%為1分，10% ～50%為2分，＞50%為3分。③按上述兩項指標的分數(shù)乘積分為:0分為陰性(－)，1～2分為弱陽性(+)，3～4分為中度陽性(++)，＞4分為強陽性(+++)。

1.4 統(tǒng)計學分析

采用 SPSS15.0統(tǒng)計軟件包進行統(tǒng)計學分析。MCM5蛋白陽性率的分析比較采用卡方檢驗和Fisher＇s精確概率檢驗，以P＜0.05為有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 非小細胞肺癌組及正常肺組織組中的MCM5蛋白表達情況(表1)

MCM5蛋白在正常肺組織組和非小細胞肺癌組中陽性率分別為12.50%和59.97%，兩組比較有顯著性差異(χ2=23.27 ，P=0.000)。

2.2 MCM5表達與非小細胞肺癌臨床病理特征的關系(表2)

MCM5陽性表達與NSCLC組織學類型及分化程度無關;淋巴結轉移陽性組與陰性組陽性表達率比較有顯著統(tǒng)計學意義(χ2=5.907，P=0.015);Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ期間比較有顯著統(tǒng)計學意義(χ2=4.657，P=0.031)。

3 討論

在腫瘤發(fā)生過程中，細胞周期調控異常是其內在原因，細胞增殖調控異常與腫瘤的發(fā)生關系密切，而腫瘤細胞增殖活性與腫瘤生物學行為更是密切相關，是用于反映腫瘤良惡性及惡性程度的重要指征。研究發(fā)現(xiàn)，MCM蛋白與細胞周期密切相關，是啟動細胞DNA復制并調控細胞由G1期進入S期的關鍵性蛋白，其本質是1種核蛋白復合物。目前發(fā)現(xiàn)在靜止/分化細胞中MCM蛋白不表達，而在增殖/腫瘤細胞中呈高表達，是近年來發(fā)現(xiàn)的1種較好地反映細胞增殖活性的新指標。大量研究表明［2，3］MCM蛋白能夠敏感而特異地反映細胞的增殖狀況，在判斷腫瘤的惡性度及評估預后方面有著較重要的意義。MCM 5是MCM蛋白復合物之一，是1種與細胞增殖密切相關的因子，它的檢測可直接反映MCM蛋白的表達水平［4］。Sirieix等［5］檢測食管標本發(fā)現(xiàn)在食管癌中呈強陽性表達。而在大多研究表明，MCM5與惡性腫瘤的發(fā)生、腫瘤細胞的浸潤和轉移及惡性程度關系密切，可以作為預測惡性腫瘤發(fā)生發(fā)展和判斷預后的生物學指標，為惡性腫瘤的臨床治療提供可靠的理論依據(jù)。國內以往對乳腺癌［6］、食管癌［7］等進行過研究，取得了一些進展，但對非小細胞肺癌的研究甚少，其檢測在非小細胞肺癌中的表達可能具有更重要臨床意義。

表1 非小細胞肺癌及正常肺組織中MCM5蛋白表達情況(例，%)

表2 MCM5表達與非小細胞肺癌臨床病理參數(shù)的關系(例，%)

本實驗結果顯示，MCM5在正常肺組織、非小細胞肺癌組織中均存在不同程度的表達，且陽性率呈上升趨勢，正常肺組織、非小細胞肺癌組織中其表達差異有統(tǒng)計學意義，這與段智［6］、趙銘等［7］在乳腺癌及食管癌中的結果基本一致。Sirieix等［6］檢測食管標本發(fā)現(xiàn)MCM5在食管癌中呈強陽性表達，而在大多數(shù)正常食管黏膜中為陰性，與本實驗結果一致，提示MCM5能較好地反映腫瘤細胞的增殖特性，對腫瘤的診斷有一定意義，說明MCM5可能參與了非小細胞肺癌的發(fā)生和進展;在非小細胞肺癌中，MCM5陽性率與腫瘤分化程度無關。MCM5陽性率與TNM分期及淋巴結的轉移均有相關性。說明MCM5作為強有力的增殖指標，它的高表達與非小細胞肺癌的發(fā)生、發(fā)展和預后密切相關。與 Cinzia的試驗結果一致［8］，本文結果提示，MCM5可能是區(qū)分非小細胞肺癌不同病理分期的有價值的分子標志物，對治療選擇及預后評估有參考意義，但有待于后繼更大樣本驗證。本研究表明，MCM5表達，對非小細胞肺癌的輔助診斷也具有一定的價值。

總之，MCM5蛋白可能與非小細胞肺癌發(fā)生發(fā)展密切相關，可能促進癌組織的浸潤和轉移，其陽性表達可能反映了非小細胞肺癌細胞的增殖活性，并能估計非小細胞肺癌發(fā)生浸潤和轉移的潛能。

［1］ Greenspan DL，Connolly DC，Wu R，et al.Loss of FHIT expression in cervical carcinoma cell lines and primary tumors〔J〕.Cancer Res，1997，57:4692.

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［3］ Madine MA，Swietlik M，Pelizon C，et al.The roles of the MCM，ORC，and cdc6 proteins in determing the replication competence of chromatin in quiescent cells〔J〕.JStruct Biol，2000，129:198.

［4］ Guida T，Salvatore Gb，F(xiàn)aviana P，et al.Mitogenic effects of the upregulation of minichromo-some maintenance proteins inanaplastic thyroid carcinoma〔J〕.Clin Endocrinol Metab，2005，90(8):4703.

［5］ Sirieix PS，O＇Donovan M，Brown J，etal.Surface expression of minichromosome maintenance proteins provides a novel method for detecting patients at risk for developing adenocarcinoma in Barrett＇s esophagus〔J〕.Clin Cancer Res，2003，9(7):2560.

［6］ 段 智，李代強.MCM5和E2F-2在乳腺癌組織中的表達及意義〔J〕.中國現(xiàn)代醫(yī)藥雜志，2007，9(4):19.

［7］ 趙 銘，徐克平，趙建強.食管癌內鏡活檢組織中Survivin和Mcm5的表達及臨床意義〔J〕.臨床肺科雜志，2010，15(5):687.

［8］ Cinzia S，Victoria W，Balaji M，et al.Improved screening for analneoplasia by immunocytochemical detection ofminichromos omemaintenance proteins〔J〕.Cancer Epidemiol Biomarkers Prev，2008，17(10):2855.