Eduard ROGATSKY, Matthew GALLITTO, Daniel T.STEIN

單向閥對(duì)于高效液相色譜(HPLC)泵硬件來說是一個(gè)重要的機(jī)械部件。在參考文獻(xiàn)[1]中對(duì)單向閥的功能和硬件設(shè)計(jì)進(jìn)行了詳細(xì)描述。簡(jiǎn)單來說，就是一對(duì)單向閥(入口和出口)阻止流體在HPLC泵頭里從高壓區(qū)流向低壓區(qū)，從而泵的活塞在高壓下使流動(dòng)相通過色譜柱?！耙粋€(gè)功能適宜的單向閥必須能夠快速方便地打開和關(guān)閉，同時(shí)還要確保密閉性在一個(gè)寬的壓力值范圍內(nèi)均有效[1]”。

根據(jù)定義，HPLC泵上的單向閥是在高壓下承受重復(fù)的機(jī)械壓力，因此這個(gè)設(shè)備比HPLC泵的其他部件(例如活塞或活塞密封圈)更易出現(xiàn)故障。但在單向閥出現(xiàn)故障時(shí)卻很難識(shí)別，雖然HPLC可以通過泵壓力下降準(zhǔn)確地檢測(cè)不同種類的外部泄漏，然而遺憾的是泵內(nèi)部連接的漏液卻是比較復(fù)雜的，因?yàn)榇藭r(shí)不會(huì)有一個(gè)明顯的壓力下降，所以HPLC軟件程序中的診斷算法也無法識(shí)別。

已有人在運(yùn)行高通量的多維液相色譜時(shí)發(fā)現(xiàn)了這個(gè)問題[2]。他們觀察到在這個(gè)應(yīng)用程序中，被分析物的保留時(shí)間非常慢但是平穩(wěn)增加大約10%；然而硬件診斷測(cè)試卻能成功通過。這種現(xiàn)象不能解釋為色譜柱的損壞，而且正如所預(yù)料的那樣換色譜柱是無益的。這個(gè)問題需要通過替換安捷倫1100二元HPLC泵(Agilent Technologies, Palo Alto, CA)B泵頭(提供有機(jī)溶劑)上的出口單向閥才能解決。值得注意的是，替換A泵頭的單向閥不會(huì)影響保留時(shí)間(數(shù)據(jù)沒有列出)。

Agilent 1100系列二元泵G1312A由兩個(gè)一模一樣的溶劑傳輸通道(泵頭)組成。每個(gè)泵頭使用兩個(gè)活塞來輸送溶劑，即入口和出口單向閥(圖1)。為了找出可能的泵故障，壓力測(cè)試(PT)和漏液測(cè)試(LT)可作為ChemStation軟件(Agilent)的一部分。壓力測(cè)試僅使用A通道使壓力增加到390 bar，然后泵流速關(guān)閉。預(yù)期的壓降應(yīng)該不超過2 bar/min。這種測(cè)試能有效地評(píng)估外部泄漏；然而內(nèi)部泄漏可能仍舊存在并且很難發(fā)現(xiàn)。例如，對(duì)12個(gè)已使用過的出口單向閥進(jìn)行試驗(yàn)研究，其中一些雖能成功通過壓力測(cè)試，但是不能通過漏液測(cè)試，漏液測(cè)試對(duì)內(nèi)泄漏評(píng)估更有效。在這個(gè)測(cè)試中，每個(gè)活塞以3 μL/min速度傳輸30 s，所得到的壓力曲線應(yīng)是水平的(穩(wěn)定水平)或是極小正數(shù)，換句話說，如果壓力出現(xiàn)負(fù)的斜率，測(cè)試就失敗了，意味著所輸送的異丙醇100%的損失。壓力曲線是水平的而不是降低的內(nèi)漏是ChemStation診斷方法/算法認(rèn)為可接受的內(nèi)漏。當(dāng)溶劑傳輸時(shí)在活塞1的沖擊下通過一個(gè)發(fā)生故障的入口單向閥部分回流到溶液存儲(chǔ)器中，此時(shí)就會(huì)發(fā)生內(nèi)漏。或者，溶液在活塞2的沖擊下通過發(fā)生故障的出口單向閥部分回流到室1。當(dāng)活塞2傳輸溶劑時(shí)，充滿大氣壓的室1會(huì)發(fā)生從高壓到低壓的回流。內(nèi)漏影響泵頭傳輸?shù)膶?shí)際流速，它比軟件預(yù)調(diào)的值少。流量計(jì)可以測(cè)出泵流量，理論上，在安裝流速限制器(例如毛細(xì)管) 之后，精確流量計(jì)可以檢測(cè)出微小的內(nèi)泄露。然而，一個(gè)液體流量計(jì)價(jià)格昂貴，且很難保證同步性，在分析實(shí)驗(yàn)室里很少使用。因此檢測(cè)內(nèi)泄漏極具挑戰(zhàn)性。

如上所述，增加的保留時(shí)間可以用來解釋流動(dòng)相在泵頭B(傳輸有機(jī)相)的內(nèi)泄漏。這樣的泄漏從傳輸泵頭室2到計(jì)量泵頭室1都可能發(fā)生。如果出口單向閥的球座壞了也可能發(fā)生回流。因此越少的有機(jī)溶劑通過泵傳輸?shù)缴V柱，保留時(shí)間就越長(zhǎng)。保留時(shí)間增加的另外一種可能是通過一個(gè)沒有完全關(guān)閉的入口單向閥從室1漏液。理論上，如果泵頭A的機(jī)械耐用性比泵頭B高(導(dǎo)致更多的內(nèi)漏)，這樣的循環(huán)將會(huì)減少被分析物的保留時(shí)間。這種漂移，可能會(huì)錯(cuò)誤的解釋為是色譜柱損壞造成的結(jié)果。

一般的HPLC診斷測(cè)試無法診斷出微量的內(nèi)漏液，所以研發(fā)出一系列的性能測(cè)試，以期設(shè)計(jì)出解決潛在的單向閥溶液傳輸問題故障的方法。實(shí)驗(yàn)是在Agilent 1100系列二元泵G1312A和紫外檢測(cè)器G1314A上完成的。

我們建議以下的方法。在泵維護(hù)或修理后，在相同流量下，使用水作為流動(dòng)相A和水/0.1%丙酮作為流動(dòng)相B運(yùn)行30 min的梯度，更換一根色譜柱，安裝上背壓閥。作者使用1.5 mX65 μm i.d.的PEEK管(p#1560,IDEX/Upchurch, Oak Harbor, WA)作為一個(gè)零死體積的流量限制器，這種管子在0.5 mL/min時(shí)產(chǎn)生250 bar的壓力。然后，達(dá)到最大吸收信號(hào)一半時(shí)的保留時(shí)間可以通過254 nm波長(zhǎng)的紫外曲線計(jì)算出來[3]。通過減去梯度前的平衡時(shí)間和二分之一的程序設(shè)定梯度時(shí)間（半梯度時(shí)間），我們就可以得到最大信號(hào)一半時(shí)的延遲時(shí)間和半梯度時(shí)間[3]，并且可以計(jì)算出流量所允許的延遲體積V50的倍增系數(shù)。理想的二元泵(沒有死體積，同時(shí)A、B兩通道操作完全相同)的V50的值與半梯度體積相同。換句話說，在到達(dá)半梯度時(shí)間點(diǎn)時(shí)，通道傳輸相同的流量和紫外信號(hào)最大值的一半是可以預(yù)計(jì)的。

當(dāng)泵有確定的死體積時(shí)，到達(dá)最大信號(hào)半值的時(shí)間會(huì)發(fā)生延遲。如果A通道內(nèi)泄漏，則會(huì)使A通道傳輸更少的流動(dòng)相，導(dǎo)致最大信號(hào)半值更早發(fā)生，V50的值將減少(梯度比預(yù)料的稍微更陡)。在B通道微小的漏液將導(dǎo)致最大信號(hào)半值延遲，V50的值將變大。比較前后所獲得的紫外曲線，即使呈現(xiàn)不同梯度也可能并不是漏液的問題，而是 B的預(yù)處理 (在溶劑中丙酮的百分含量)不精確或紫外燈效能降低所導(dǎo)致的。

相比之下，無論信號(hào)最大值如何變化，V50的值是不變的。當(dāng)V50的值確定后，在當(dāng)前硬件配置中，它可以作為一個(gè)給定的泵(梯度識(shí)別) 的參比值。值得注意的是，這個(gè)值與壓力、溫度和硬件都有關(guān)。如果在V50中和之前的測(cè)量對(duì)比存在5%的偏差，但是診斷測(cè)試完全成功，作者則建議交換AB出口單向閥并重復(fù)測(cè)試。再次強(qiáng)調(diào)，V50的增加意味著B通道漏液，減低說明A通道漏液。轉(zhuǎn)換出口閥后重新檢查梯度運(yùn)行，最新得到的V50值增加說明出口單向閥有故障，如果V50值仍然不變，說明在以上懷疑的通道中入口閥出現(xiàn)故障。

因?yàn)榇罱ǖ脑\斷測(cè)試不能識(shí)別微泄漏，所以嚴(yán)格控制V50的值對(duì)確保快速硬件診斷與維修而言就顯得尤為重要。被分析物保留時(shí)間的漂移可以很明確地指出與這個(gè)硬件相關(guān)的漏液情況。在40~60 min的梯度(常用的蛋白質(zhì)組學(xué)分析)實(shí)驗(yàn)中，我們應(yīng)該評(píng)價(jià)每個(gè)溶液傳輸通道性能，用以排除硬件對(duì)保留時(shí)間不穩(wěn)定的影響。如果V50值先前未確定或不能進(jìn)行常規(guī)監(jiān)控,那么診斷和維修會(huì)更為復(fù)雜和冗長(zhǎng)。因此,使用高壓液體流量計(jì)對(duì)于系統(tǒng)性能控制而言，可能是快速的但卻花費(fèi)昂貴的選擇。

[1] Dolan J.Check valve problems.LC·GC North Amer, 2006,24: 132 - 8.

[2] Rogatsky E, Braaten K, Cruikshank G, Jayatillake H, Zheng B, Stein D T.Flow inconsistency: the evil twin of column switching - hardware aspects.J Chromatogr A, 2009, 1216:7721 - 7.

[3] Dolan J.Dwell volume revisited.LC ·GC North Amer, 2006,24: 458 - 66.