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        對氨基酸紙層析實驗的改進

        2011-04-26 11:19:46陳舒麗王梅娟羅麗丹劉漢才羅德生咸寧學院基礎(chǔ)醫(yī)學院生物化學與分子生物學教研室咸寧437100通訊作者mailjxa12419126com
        山西醫(yī)科大學學報 2011年3期
        關(guān)鍵詞:實驗

        陳舒麗, 王梅娟, 羅麗丹, 劉漢才, 羅德生 (咸寧學院基礎(chǔ)醫(yī)學院生物化學與分子生物學教研室, 咸寧437100;通訊作者,E-mail:jxa12419@126.com)

        紙層析是以濾紙作為支持物分離混合物的一種分配層析方法。濾紙纖維和水有較強的親和力,與有機溶劑的親和力很弱。故而在層析時,以濾紙纖維及其結(jié)合的水作為固定相,以有機溶劑作為流動相。當流動相沿紙經(jīng)過樣品時,樣品點上的溶質(zhì)在水和有機相之間不斷進行分配,隨著流動相的不斷移動,各種不同的部分按其各自的分配系數(shù)不斷進行分配,從而使物質(zhì)得到分離和提純[1]。紙層析法是常用的一種分離混合氨基酸的方法,也是大中專院校生物化學實驗中的一個常規(guī)性實驗。在多年的實驗教學中,我們發(fā)現(xiàn)有些試劑及實驗步驟需要改進。傳統(tǒng)實驗中,通常用苯酚做展層劑。苯酚是一種有毒物質(zhì),對皮膚有較強的腐蝕性,對人體毒性較大,而且價格較貴。傳統(tǒng)實驗中,氨基酸層析完畢后,用茚三酮溶液噴霧顯色,由于噴霧不均,容易造成顯色不均。本研究將茚三酮加入展層劑中,通過比較苯酚與3種濃度不同的乙醇作為展層劑的效果,從而降低實驗試劑對人體的危害,簡化實驗步驟,降低實驗成本,現(xiàn)報告如下。

        1 材料與方法

        1.1 實驗材料 0.1 mol/L丙氨酸溶液,0.1 mol/L谷氨酸溶液,0.1 mol/L丙氨酸及谷氨酸混合液,0.01 mol/L(pH 7.4)磷酸鹽緩沖液,0.1% 茚三酮溶液,水飽和苯酚溶液,65%,75%,85%乙醇-茚三酮溶液。

        1.2 實驗方法

        1.2.1 點樣 取直徑10 cm圓形濾紙一張,用圓規(guī)作半徑0.8 cm的同心圓,將圓周平均分成三部分,分別標記1,2,3。用毛細管在濾紙的1處點加丙氨酸和谷氨酸混合液2滴,2和3兩處分別點加丙氨酸和谷氨酸溶液各1滴。

        在濾紙圓心處打一小孔(如鉛筆芯大小),另取一條狀濾紙,長約4 cm,寬約2 cm,下一半剪成須狀,卷成圓筒,如燈芯插入小孔,勿使其突出濾紙面。

        1.2.2 層析和顯色 在8個直徑為10 cm的圓形層析缸中分別加入4種不同的展層劑,即水飽和苯酚,65%,75%,85%乙醇溶液(含0.1%茚三酮),每種溶液均平行做2份。把濾紙平放在展層缸上,使燈芯浸入展層劑中,溶劑沿燈芯上升到濾紙,并向四周擴散,待溶劑前沿擴散至濾紙邊緣約1 cm時,取出濾紙,用鉛筆劃出溶劑前沿,在烤箱中烤干。由于乙醇展層劑中直接加入了茚三酮,故從烤箱中取出的6張濾紙上有紫色的弧形色斑;用水飽和苯酚做展層劑的濾紙拿出后噴0.1%茚三酮溶液,放入烤箱中第二次烤干,出現(xiàn)紫色的弧形色斑。用鉛筆描出色斑輪廓,取兩份平行結(jié)果的平均值,以下列公式計算遷移率(Rf):

        2 結(jié)果

        經(jīng)過展層作用后,谷氨酸與丙氨酸在4種展層劑中的遷移率見表1,層析圖譜見圖1-4。

        表1 兩種氨基酸在四種配方中的遷移率

        圖1 不同展層劑的層析圖譜

        通過計算2種氨基酸的Rf值及8張濾紙的層析圖譜結(jié)果可以看到:點樣1處的混合氨基酸均可以分離,離點樣點較遠的斑點為丙氨酸,離點樣點較近的斑點為谷氨酸;水飽和苯酚溶液和75%乙醇分離氨基酸的效果最為明顯,且2種氨基酸在2種展層劑中的遷移率也較接近;65%乙醇分離效果不如上述2種展層劑明顯,但是仍然可以分離;而85%乙醇分離效果較差,2種氨基酸的遷移率均較小。由此可以說明,用75%乙醇制成的展層劑能達到分離混合氨基酸的目的,而且效果較好。

        3 討論

        3.1 兩種展層劑的比較 原展層劑中苯酚是一種有毒的有機試劑,對皮膚、黏膜有強烈的腐蝕作用,可抑制中樞神經(jīng)或損害肝、腎功能;吸入蒸氣可引起頭痛、頭昏、乏力、視物模糊等癥狀[2]。由于腐蝕性極強,操作時應(yīng)戴手套及防護鏡等,所有操作均應(yīng)在通風櫥中進行;這些都給實驗操作帶來不便。而新展層劑中的乙醇則安全無毒,沒有腐蝕性。因此在實驗操作中,無須戴手套,也不用在通風櫥中進行。這些既簡化了實驗的操作過程,又避免了苯酚對實驗人員的毒性;而且與苯酚相比較,乙醇價格便宜,可以節(jié)約實驗室開支[3]。

        3.2 兩種顯色方法的比較 如果展層劑中沒有加入顯色劑茚三酮,需展層完畢烘干后將茚三酮噴霧在濾紙上。由于是手動操作,容易造成噴霧不均,色斑顯色不均勻,易擴散,使得濾紙表面不干凈,影響Rf值的測定。為了克服這一缺點,本實驗將茚三酮溶解于展層劑中[4]。在層析過程中,茚三酮隨展層劑沿濾紙向四周擴散,由于固定了顯色劑的量,故從烤箱中取出濾紙后能看見藍紫色色斑均勻分布在濾紙上,顯色效果較好,濾紙表面比較干凈,利于Rf值的測定,不僅縮短了實驗時間,而且使操作更簡單,效果更好[5]。

        綜上所述,用75%乙醇配制的展層劑,可以代替原有的水飽和苯酚,能夠較好地分離氨基酸;另外將茚三酮加入展層劑中,可以更好地顯色。以上改進,不僅簡化了實驗步驟,縮短了實驗時間,優(yōu)化了實驗結(jié)果,并且對人體沒有任何毒性和腐蝕性,達到了預(yù)期的效果。

        [1] 羅德生,劉紅梅,李映紅,等.生物化學與分子生物學實驗教程[M].北京:科學出版社,2007:83-85.

        [2] 楊若明.環(huán)境中有毒有害化學物質(zhì)的污染與監(jiān)測[M].北京:中央民族大學出版社,2001:152-154.

        [3] 王筑婷,吳青青.圓形紙層析法鑒定轉(zhuǎn)氨基作用的實驗改進[J].貴陽醫(yī)學院學報,2008,33(4):418 -419.

        [4] 榻金彩,周桂.對“植物體內(nèi)的轉(zhuǎn)氨基作用”實驗的改進[J].生物學通報,2006,41(1):50 -51.

        [5] 田明,高錚,蘇英華,等.氨基酸紙層析實驗的進一步探討[J].實驗室科學,2009,28(6):64 -65.

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