閆麗雋， 趙 欣， 邵淑麗 (山西省腫瘤醫(yī)院婦科， 太原 030013;通訊作者，E-mail:YLJ7576@sina.com)

子宮頸癌是全球婦女最常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，在發(fā)展中國(guó)家尤為常見(jiàn)，是婦科三大惡性腫瘤之一，其死亡率占中國(guó)女性癌癥的第2位［1，2］。在子宮頸癌的組織學(xué)分型中鱗狀細(xì)胞癌(包括角化型43.3%，非角化型 29.1%，小細(xì)胞型 10.9%)就占83.3%。鱗狀上皮細(xì)胞癌抗原(SCC-Ag)作為鱗癌相關(guān)抗原，其血清學(xué)檢測(cè)已被廣泛用于臨床子宮頸癌的輔助診斷，且具有器官特異性較高和良性疾患特異性較低的特點(diǎn)，但值得注意的是在體外收集標(biāo)本和測(cè)量過(guò)程中存在影響因素，如皮膚污染和涎液可能強(qiáng)烈影響SCC-Ag的水平，在患一些良性疾病如肺結(jié)核、支氣管囊腫、皮膚濕疹、牛皮癬等時(shí)，SCC-Ag也可以升高。Buyru等［3］發(fā)現(xiàn)檢測(cè)癌癥患者外周血中SCCA mRNA可以改善常規(guī)檢查的較低診斷率，我們用TaqMan探針real-time-PCR方法檢測(cè)子宮頸鱗狀細(xì)胞癌組織中SCCA1 mRNA和SCCA2 mRNA的表達(dá)并探討其臨床意義。

1 資料與方法

1.1 病例來(lái)源 選擇2006－01～2007－01山西省腫瘤醫(yī)院首診的子宮頸鱗癌患者60例，采用FIGO1985年臨床分期標(biāo)準(zhǔn)分期，其中Ⅰ期28例、Ⅱ期20例、Ⅲ期12例(取門(mén)診首診患者活檢組織)，年齡27－66歲，平均年齡53.93歲。收集手術(shù)切除的子宮頸鱗癌新鮮癌組織標(biāo)本，取30例因子宮肌瘤作全子宮切除的正常子宮頸組織作對(duì)照(均經(jīng)病理證實(shí))。

1.2 試劑 Trizol液，氯仿，異丙醇，70%乙醇，DEPC水，M-MLV cDNA Kit(上海生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司);瓊脂糖(AgaroseⅡ，加拿大 BBI公司)，擴(kuò)增試劑盒TagMan universal master mix reactions(Applied Biosystems，F(xiàn)oster City，CA)美國(guó) Taq-Man公司;基因表達(dá)試劑盒(Applied Biosystems，F(xiàn)oster City，CA)美國(guó)TaqMan公司。

1.3 方法

1.3.1 總RNA提取 采用Trizol試劑提取子宮頸組織中總RNA，取1 μl經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)RNA完整性。

1.3.2 cDNA合成 應(yīng)用M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶(上海生工)制備cDNA，以O(shè)ligo-p(dT)為引物，按說(shuō)明書(shū)操作合成cDNA第一鏈。操作步驟:模板RNA 2 μl，Oligo-p(dT)引物 1 μl，RNase-free H2O，定容至12 μl，70 ℃ 5 s。再加入 5 × 反應(yīng)液 4 μl，RNase 滅活酶 1 μl，dNTP Mix(10 mmol/L)2 μl，37 ℃ 5 s。加M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶1 μl 37℃ 60 s，70℃ 10 s終體積為 20 μl，結(jié)束反應(yīng)，加 RNase-free H2O 至 200 μl，－80℃冷凍保存。

1.3.3 RT-PCR 在 ABI Prism 7000(ABI公司，美國(guó))實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀上進(jìn)行實(shí)時(shí)定量擴(kuò)增，總反應(yīng)體系為 25 μl，含 TaqMan 總反應(yīng)體系 12.5 μl，上游和下游引物各 1.25 μl，TaqMan Probe RNasefree H2O 6.25 μl，cDNA 5 μl。反應(yīng)條件為:2 min 50℃，95 ℃ 10 min，95 ℃ 15 min，60 ℃ 1 min，共50 個(gè)循環(huán)，所有測(cè)定為雙管重復(fù)，以GAPDH為內(nèi)參照基因。引物設(shè)計(jì)見(jiàn)表1。

表1 引物序列Tab 1 Primer sequence

1.4 結(jié)果判定 在每次實(shí)驗(yàn)中系統(tǒng)濃度稀釋被用來(lái)測(cè)定擴(kuò)增效率。SCCA1和 SCCA2基因相對(duì)于GAPDH的相對(duì)表達(dá)計(jì)算如下:相對(duì)表達(dá)率用公式△Ct=Ct目的基因－ Ct內(nèi)參照基因，表示其表達(dá)的相對(duì)拷貝數(shù)，△Ct值越低，實(shí)際拷貝數(shù)越高。

2 結(jié)果

2.1 SCCA1和SCCA2 mRNA在子宮頸癌的表達(dá)SCCA2 mRNA在子宮頸鱗癌組織與正常子宮頸組織中的表達(dá)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.001)。SCCA2 mRNA在宮頸癌組織中表達(dá)較正常子宮頸組織中△Ct值低，其實(shí)際含量則高。而SCCA1 mRNA在兩種組織中的表達(dá)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05，見(jiàn)表1)。

在癌組織中SCCA2 mRNA的表達(dá)高于SCCA1 mRNA，經(jīng)配對(duì)t檢驗(yàn)分析，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=－11.347，P ＜0.001)。

表2 SCCA1和SCCA2 mRNA在宮頸鱗癌組織和正常宮頸組織中的表達(dá)Tab 2 Expression of SCCA1 and SCCA2 mRNA in tissues of cervical squamous cell carcinoma and normal cervix

2.2 子宮頸癌組織中SCCA mRNA表達(dá)與子宮頸鱗癌患者臨床病理特征的關(guān)系 有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的宮頸鱗癌組織中SCCA2 mRNA的表達(dá)較無(wú)淋巴轉(zhuǎn)移的癌組織高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=2.853，P＜0.01)，而SCCA1 mRNA的表達(dá)則無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

不同年齡及不同病理分級(jí)中SCCA2 mRNA及SCCA1 mRNA的表達(dá)差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

經(jīng)單因素方差分析，不同臨床分期的患者癌組織中SCCA2 mRNA的表達(dá)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=8.313，P=0.002)，經(jīng) LSD 法兩兩比較，三組間兩兩比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，然后進(jìn)行Sperman秩相關(guān)分析，結(jié)果顯示 r= －0.616，P ＜0.001，說(shuō)明隨著臨床分期的增高，SCCA2 mRNA的表達(dá)增高。而SCCA1 mRNA在不同臨床分期之間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=2.734，P=0.083)。

表3 SCCA mRNA表達(dá)與年齡、淋巴轉(zhuǎn)移、病理分級(jí)、臨床分期的關(guān)系Tab 3 Correlation of expression of SCCA mRNA with age，lymph node metastases，histological grade and FIGO stages

3 討論

鱗狀上皮細(xì)胞癌抗原(SCC-Ag)作為鱗癌相關(guān)抗原，血清學(xué)檢測(cè)已廣泛被用于臨床子宮頸鱗癌輔助診斷，鱗狀上皮細(xì)胞癌抗原(SCC-Ag)是絲氨酸蛋白酶抑制劑家族的一個(gè)成員，存在于子宮頸、子宮、頭頸等鱗狀上皮細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中，特別是在非角化大細(xì)胞中含量豐富。但單獨(dú)測(cè)定SCC-Ag不能作為子宮頸鱗癌的診斷依據(jù)。Bugru等［3］發(fā)現(xiàn)檢測(cè)癌癥患者外周血中SCCA mRNA可以改善常規(guī)檢查的較低診斷率。SCCA就其生物學(xué)活性來(lái)說(shuō)屬絲氨酸蛋白酶抑制劑家族的成員，目前產(chǎn)生SCCA的兩種形式的基因SCCA1和SCCA2已被鑒別，其定位在常染色體 18q21.3 中大約 500 kb 的區(qū)域［4，5］，SCCA1和SCCA2在核苷酸水平上有98%的同源性，在氨基酸水平上有92%的同源性［6］，兩種基因分別編碼SCCA的兩種形式，SCCA1編碼中性形成的蛋白，SCCA2編碼酸性形成的蛋白。Barnes等［7］研究發(fā)現(xiàn)，SCCA2在宮頸鱗癌中的表達(dá)明顯增高，他認(rèn)為此基因是更重要的腫瘤標(biāo)記物。

在組織中檢測(cè)mRNA水平的SCCA1和2是困難的，因?yàn)閮烧咴诤塑账崴缴嫌懈叨鹊耐葱?，Takeda等［8］發(fā)現(xiàn)用 RT-PCR可以區(qū)別組織中 SCCA1和SCCA2 mRNA的表達(dá)，同時(shí)Zen等［9］測(cè)定口腔鱗癌患者外周血中的SCCA mRNA和表皮生長(zhǎng)因子mRNA，使用一般RT-PCR只能在少數(shù)病例中測(cè)到，而使用TaqMan RT-PCR時(shí)大約50%病例中有表達(dá)。本研究采用TaqMan探針實(shí)時(shí)熒光定量法分析60例子宮頸鱗癌組織及30例正常子宮頸組織中SCCA1和SCCA2 mRNA的表達(dá)，結(jié)果表明，SCCA2 mRNA在宮頸鱗癌組織表達(dá)明顯高于正常宮頸組織，而SCCA1 mRNA在兩組間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)，Murakami等［10］研究發(fā)現(xiàn) SCCA2 mRNA 的拷貝數(shù)在惡性組織中比正常組織中高，而SCCA1則沒(méi)有明顯的不同。這與本試驗(yàn)的研究結(jié)果相符。并且Murakami等還認(rèn)為有效地定量SCCA2 mRNA在鱗癌患者診斷和治療過(guò)程中是非常有意義的。因?yàn)镾CCA2調(diào)節(jié)細(xì)胞遷移和侵襲病毒感染相關(guān)抗原E鈣蛋白的表達(dá)，而E鈣黏蛋白是一個(gè)與子宮頸鱗癌浸潤(rùn)轉(zhuǎn)移有關(guān)的預(yù)后因素［11］，因此他們認(rèn)為SCCA2可能與癌的侵襲和轉(zhuǎn)移行為有關(guān)。Nawata等［12］認(rèn)為過(guò)度表達(dá)的SCCA2基因可能在腫瘤細(xì)胞的共性行為中扮演重要角色。

SCCA2 mRNA的表達(dá)與淋巴轉(zhuǎn)移的關(guān)系:腫瘤的浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移是惡性腫瘤發(fā)展的兩個(gè)關(guān)鍵步驟，也是影響預(yù)后的重要因素，腫瘤的轉(zhuǎn)移是個(gè)高選擇、多步驟、多因素參與腫瘤細(xì)胞和宿主細(xì)胞相互作用的連續(xù)過(guò)程。子宮頸癌以直接侵犯鄰近組織和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移為主，血行轉(zhuǎn)移極少，影響子宮頸癌預(yù)后的臨床病理因素很多，其中淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移是顯著的獨(dú)立預(yù)后因素。文獻(xiàn)報(bào)道，無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者5年生存率為82.2%，有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者 5年生存率則為50.8%［13］。本實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組 SCCA2 mRNA的表達(dá)較無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組高(t=2.853，P＜0.01)，SCCA1 mRNA表達(dá)則無(wú)此特點(diǎn)。由于腫瘤的浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移都需要細(xì)胞外基質(zhì)和基底膜的降解，推斷SCCA2能夠改變鱗癌細(xì)胞的侵襲表型，可能是通過(guò)刺激MMP-9蛋白的產(chǎn)生，而明膠酶MMP-9能分解基質(zhì)膜中的巢蛋白，在腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移中起重要作用。另外，試管內(nèi)侵襲分析發(fā)現(xiàn)SCCA1和SCCA2能顯著助長(zhǎng)細(xì)胞的侵襲能力。本實(shí)驗(yàn)僅發(fā)現(xiàn)SCCA2有此特點(diǎn)，因此還需大樣本實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步證實(shí)。

SCCA2 mRNA的表達(dá)與臨床分期的關(guān)系:近年來(lái)臨床上提出了“腫瘤分子分期”的觀點(diǎn)，即將分子生物學(xué)的理論和技術(shù)與腫瘤的臨床分期有機(jī)地結(jié)合起來(lái)，來(lái)診斷那些常規(guī)檢查方法不能診斷的存在于全身各系統(tǒng)中的亞臨床轉(zhuǎn)移，使腫瘤的分期更加準(zhǔn)確，以指導(dǎo)臨床治療方案的確定。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示隨臨床分期的增高，子宮頸鱗癌組織中SCCA2 mRNA的表達(dá)有增高趨勢(shì)(r= －0.616，P ＜0.001)，SCCA2 mRNA的檢測(cè)有助于準(zhǔn)確分期，從而更加有針對(duì)性制定個(gè)性化的治療方案，為改善預(yù)后提供可能。

SCCA1和SCCA2 mRNA在鱗狀上皮層呈特異性地表達(dá)，應(yīng)用TaqMan探針real-time-PCR方法可以定量檢測(cè)mRNA的水平，能夠較直觀反映宮頸癌組織中SCCA的表達(dá)水平，為SCCA在宮頸癌的早期診斷、臨床分期及預(yù)后提供一定的理論依據(jù)，但關(guān)于SCCA1和SCCA2在腫瘤的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中的各自及相互作用機(jī)制還需要深入研究。

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