閆麗雋， 趙 欣， 邵淑麗 (山西省腫瘤醫(yī)院婦科， 太原 030013;通訊作者，E-mail:YLJ7576@sina.com)

子宮頸癌是全球婦女最常見的惡性腫瘤之一，在發(fā)展中國家尤為常見，是婦科三大惡性腫瘤之一，其死亡率占中國女性癌癥的第2位［1，2］。在子宮頸癌的組織學分型中鱗狀細胞癌(包括角化型43.3%，非角化型 29.1%，小細胞型 10.9%)就占83.3%。鱗狀上皮細胞癌抗原(SCC-Ag)作為鱗癌相關抗原，其血清學檢測已被廣泛用于臨床子宮頸癌的輔助診斷，且具有器官特異性較高和良性疾患特異性較低的特點，但值得注意的是在體外收集標本和測量過程中存在影響因素，如皮膚污染和涎液可能強烈影響SCC-Ag的水平，在患一些良性疾病如肺結核、支氣管囊腫、皮膚濕疹、牛皮癬等時，SCC-Ag也可以升高。Buyru等［3］發(fā)現檢測癌癥患者外周血中SCCA mRNA可以改善常規(guī)檢查的較低診斷率，我們用TaqMan探針real-time-PCR方法檢測子宮頸鱗狀細胞癌組織中SCCA1 mRNA和SCCA2 mRNA的表達并探討其臨床意義。

1 資料與方法

1.1 病例來源 選擇2006－01～2007－01山西省腫瘤醫(yī)院首診的子宮頸鱗癌患者60例，采用FIGO1985年臨床分期標準分期，其中Ⅰ期28例、Ⅱ期20例、Ⅲ期12例(取門診首診患者活檢組織)，年齡27－66歲，平均年齡53.93歲。收集手術切除的子宮頸鱗癌新鮮癌組織標本，取30例因子宮肌瘤作全子宮切除的正常子宮頸組織作對照(均經病理證實)。

1.2 試劑 Trizol液，氯仿，異丙醇，70%乙醇，DEPC水，M-MLV cDNA Kit(上海生物工程技術服務有限公司);瓊脂糖(AgaroseⅡ，加拿大 BBI公司)，擴增試劑盒TagMan universal master mix reactions(Applied Biosystems，Foster City，CA)美國 Taq-Man公司;基因表達試劑盒(Applied Biosystems，Foster City，CA)美國TaqMan公司。

1.3 方法

1.3.1 總RNA提取 采用Trizol試劑提取子宮頸組織中總RNA，取1 μl經1%瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA完整性。

1.3.2 cDNA合成 應用M-MLV反轉錄酶(上海生工)制備cDNA，以Oligo-p(dT)為引物，按說明書操作合成cDNA第一鏈。操作步驟:模板RNA 2 μl，Oligo-p(dT)引物 1 μl，RNase-free H2O，定容至12 μl，70 ℃ 5 s。再加入 5 × 反應液 4 μl，RNase 滅活酶 1 μl，dNTP Mix(10 mmol/L)2 μl，37 ℃ 5 s。加M-MLV反轉錄酶1 μl 37℃ 60 s，70℃ 10 s終體積為 20 μl，結束反應，加 RNase-free H2O 至 200 μl，－80℃冷凍保存。

1.3.3 RT-PCR 在 ABI Prism 7000(ABI公司，美國)實時熒光定量PCR儀上進行實時定量擴增，總反應體系為 25 μl，含 TaqMan 總反應體系 12.5 μl，上游和下游引物各 1.25 μl，TaqMan Probe RNasefree H2O 6.25 μl，cDNA 5 μl。反應條件為:2 min 50℃，95 ℃ 10 min，95 ℃ 15 min，60 ℃ 1 min，共50 個循環(huán)，所有測定為雙管重復，以GAPDH為內參照基因。引物設計見表1。

表1 引物序列Tab 1 Primer sequence

1.4 結果判定 在每次實驗中系統(tǒng)濃度稀釋被用來測定擴增效率。SCCA1和 SCCA2基因相對于GAPDH的相對表達計算如下:相對表達率用公式△Ct=Ct目的基因－ Ct內參照基因，表示其表達的相對拷貝數，△Ct值越低，實際拷貝數越高。

2 結果

2.1 SCCA1和SCCA2 mRNA在子宮頸癌的表達SCCA2 mRNA在子宮頸鱗癌組織與正常子宮頸組織中的表達差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.001)。SCCA2 mRNA在宮頸癌組織中表達較正常子宮頸組織中△Ct值低，其實際含量則高。而SCCA1 mRNA在兩種組織中的表達差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05，見表1)。

在癌組織中SCCA2 mRNA的表達高于SCCA1 mRNA，經配對t檢驗分析，差異有統(tǒng)計學意義(t=－11.347，P ＜0.001)。

表2 SCCA1和SCCA2 mRNA在宮頸鱗癌組織和正常宮頸組織中的表達Tab 2 Expression of SCCA1 and SCCA2 mRNA in tissues of cervical squamous cell carcinoma and normal cervix

2.2 子宮頸癌組織中SCCA mRNA表達與子宮頸鱗癌患者臨床病理特征的關系 有淋巴結轉移的宮頸鱗癌組織中SCCA2 mRNA的表達較無淋巴轉移的癌組織高，差異有統(tǒng)計學意義(t=2.853，P＜0.01)，而SCCA1 mRNA的表達則無統(tǒng)計學差異。

不同年齡及不同病理分級中SCCA2 mRNA及SCCA1 mRNA的表達差異均無統(tǒng)計學意義。

經單因素方差分析，不同臨床分期的患者癌組織中SCCA2 mRNA的表達差異有統(tǒng)計學意義(F=8.313，P=0.002)，經 LSD 法兩兩比較，三組間兩兩比較差異均有統(tǒng)計學意義，然后進行Sperman秩相關分析，結果顯示 r= －0.616，P ＜0.001，說明隨著臨床分期的增高，SCCA2 mRNA的表達增高。而SCCA1 mRNA在不同臨床分期之間差異無統(tǒng)計學意義(F=2.734，P=0.083)。

表3 SCCA mRNA表達與年齡、淋巴轉移、病理分級、臨床分期的關系Tab 3 Correlation of expression of SCCA mRNA with age，lymph node metastases，histological grade and FIGO stages

3 討論

鱗狀上皮細胞癌抗原(SCC-Ag)作為鱗癌相關抗原，血清學檢測已廣泛被用于臨床子宮頸鱗癌輔助診斷，鱗狀上皮細胞癌抗原(SCC-Ag)是絲氨酸蛋白酶抑制劑家族的一個成員，存在于子宮頸、子宮、頭頸等鱗狀上皮細胞的細胞質中，特別是在非角化大細胞中含量豐富。但單獨測定SCC-Ag不能作為子宮頸鱗癌的診斷依據。Bugru等［3］發(fā)現檢測癌癥患者外周血中SCCA mRNA可以改善常規(guī)檢查的較低診斷率。SCCA就其生物學活性來說屬絲氨酸蛋白酶抑制劑家族的成員，目前產生SCCA的兩種形式的基因SCCA1和SCCA2已被鑒別，其定位在常染色體 18q21.3 中大約 500 kb 的區(qū)域［4，5］，SCCA1和SCCA2在核苷酸水平上有98%的同源性，在氨基酸水平上有92%的同源性［6］，兩種基因分別編碼SCCA的兩種形式，SCCA1編碼中性形成的蛋白，SCCA2編碼酸性形成的蛋白。Barnes等［7］研究發(fā)現，SCCA2在宮頸鱗癌中的表達明顯增高，他認為此基因是更重要的腫瘤標記物。

在組織中檢測mRNA水平的SCCA1和2是困難的，因為兩者在核苷酸水平上有高度的同源性，Takeda等［8］發(fā)現用 RT-PCR可以區(qū)別組織中 SCCA1和SCCA2 mRNA的表達，同時Zen等［9］測定口腔鱗癌患者外周血中的SCCA mRNA和表皮生長因子mRNA，使用一般RT-PCR只能在少數病例中測到，而使用TaqMan RT-PCR時大約50%病例中有表達。本研究采用TaqMan探針實時熒光定量法分析60例子宮頸鱗癌組織及30例正常子宮頸組織中SCCA1和SCCA2 mRNA的表達，結果表明，SCCA2 mRNA在宮頸鱗癌組織表達明顯高于正常宮頸組織，而SCCA1 mRNA在兩組間差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)，Murakami等［10］研究發(fā)現 SCCA2 mRNA 的拷貝數在惡性組織中比正常組織中高，而SCCA1則沒有明顯的不同。這與本試驗的研究結果相符。并且Murakami等還認為有效地定量SCCA2 mRNA在鱗癌患者診斷和治療過程中是非常有意義的。因為SCCA2調節(jié)細胞遷移和侵襲病毒感染相關抗原E鈣蛋白的表達，而E鈣黏蛋白是一個與子宮頸鱗癌浸潤轉移有關的預后因素［11］，因此他們認為SCCA2可能與癌的侵襲和轉移行為有關。Nawata等［12］認為過度表達的SCCA2基因可能在腫瘤細胞的共性行為中扮演重要角色。

SCCA2 mRNA的表達與淋巴轉移的關系:腫瘤的浸潤和轉移是惡性腫瘤發(fā)展的兩個關鍵步驟，也是影響預后的重要因素，腫瘤的轉移是個高選擇、多步驟、多因素參與腫瘤細胞和宿主細胞相互作用的連續(xù)過程。子宮頸癌以直接侵犯鄰近組織和淋巴結轉移為主，血行轉移極少，影響子宮頸癌預后的臨床病理因素很多，其中淋巴結轉移是顯著的獨立預后因素。文獻報道，無淋巴結轉移患者5年生存率為82.2%，有淋巴結轉移者 5年生存率則為50.8%［13］。本實驗研究發(fā)現有淋巴結轉移組 SCCA2 mRNA的表達較無淋巴結轉移組高(t=2.853，P＜0.01)，SCCA1 mRNA表達則無此特點。由于腫瘤的浸潤和轉移都需要細胞外基質和基底膜的降解，推斷SCCA2能夠改變鱗癌細胞的侵襲表型，可能是通過刺激MMP-9蛋白的產生，而明膠酶MMP-9能分解基質膜中的巢蛋白，在腫瘤的侵襲轉移中起重要作用。另外，試管內侵襲分析發(fā)現SCCA1和SCCA2能顯著助長細胞的侵襲能力。本實驗僅發(fā)現SCCA2有此特點，因此還需大樣本實驗進一步證實。

SCCA2 mRNA的表達與臨床分期的關系:近年來臨床上提出了“腫瘤分子分期”的觀點，即將分子生物學的理論和技術與腫瘤的臨床分期有機地結合起來，來診斷那些常規(guī)檢查方法不能診斷的存在于全身各系統(tǒng)中的亞臨床轉移，使腫瘤的分期更加準確，以指導臨床治療方案的確定。本實驗結果顯示隨臨床分期的增高，子宮頸鱗癌組織中SCCA2 mRNA的表達有增高趨勢(r= －0.616，P ＜0.001)，SCCA2 mRNA的檢測有助于準確分期，從而更加有針對性制定個性化的治療方案，為改善預后提供可能。

SCCA1和SCCA2 mRNA在鱗狀上皮層呈特異性地表達，應用TaqMan探針real-time-PCR方法可以定量檢測mRNA的水平，能夠較直觀反映宮頸癌組織中SCCA的表達水平，為SCCA在宮頸癌的早期診斷、臨床分期及預后提供一定的理論依據，但關于SCCA1和SCCA2在腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程中的各自及相互作用機制還需要深入研究。

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