趙淑紅， 高亦瓏， 馬學(xué)琴， 楊美玲 (寧夏醫(yī)科大學(xué)高職學(xué)院， 銀川 750004;寧夏醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院)

金葉接骨木(Sambucus canadensis.Aurea)為忍冬科接骨木屬植物加拿大接骨木(Sambucus Canadensis L.)的彩色葉變種，我區(qū)作為觀賞植物從外地引進(jìn)并在銀川地區(qū)栽培［1］。接骨木屬植物有著廣泛的臨床藥用價(jià)值，其中齊墩果酸、熊果酸是接骨木屬植物抗病毒性肝炎活性成分，臨床用于治療急性病毒性肝炎療效顯著［2］。本人在前期的實(shí)驗(yàn)中檢測(cè)出金葉接骨木的莖葉中含有槲皮素、蕓香苷以及熊果酸、齊墩果酸等化學(xué)成分［3］。金葉接骨木如接骨木屬其他植物一樣具有一定藥用價(jià)值，本文對(duì)銀川地區(qū)引種的3年生金葉接骨木莖葉中齊墩果酸和熊果酸2種成分進(jìn)行含量測(cè)定，并建立高效液相色譜法測(cè)定金葉接骨木中齊墩果酸和熊果酸含量的方法，為進(jìn)一步開(kāi)發(fā)和利用其植物提供科學(xué)依據(jù)。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 日立 L2000高效液相色譜儀(L-2455DAD)檢測(cè)器，L-2300柱溫箱，L-2200自動(dòng)進(jìn)樣器，L-2130四元泵，分析天平(AP210，1/10萬(wàn))，超聲波提取器(KQ-500B)，中藥材粉碎機(jī)(FW100型)。

1.2 試藥 齊墩果酸對(duì)照品(批號(hào)110742－200314，中國(guó)藥品生物制品檢定所);熊果酸對(duì)照品(批號(hào)8502，中國(guó)藥品生物制品檢定所);甲醇(色譜純，美國(guó)TEDIA天地試劑公司);乙腈(色譜純，美國(guó)TEDIA天地試劑公司);娃哈哈純凈水;其他試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件 色譜柱:美國(guó) Thermo ODS-2HYPERSIL(250 mm ×4.6 mm，5 μm);流動(dòng)相:甲醇－0.4%磷酸水溶液(80%∶20%);檢測(cè)波長(zhǎng):210 nm，流速0.8 ml/min，柱溫:25 ℃。

2.2 對(duì)照品溶液的制備 分別精密稱(chēng)量熊果酸對(duì)照品5.0 mg、齊墩果酸對(duì)照品 1.3 mg，共同置 5 ml容量瓶中，色譜甲醇溶解，定容，得熊果酸、齊墩果酸混合對(duì)照品溶液，臨用前稀釋?zhuān)?，5］。在 2.1 項(xiàng)所述色譜條件下，取對(duì)照品溶液進(jìn)樣10 μl檢測(cè)，理論塔板數(shù)為5 000，齊墩果酸和熊果酸分離度為1.6，得色譜圖1。

圖1 齊墩果酸、熊果酸對(duì)照品HPLC色譜圖Fig 1 High performance liquid chromatogram of oleanolic acid and ursolic acid

結(jié)果顯示，齊墩果酸色譜峰保留時(shí)間為28.00 min，熊果酸色譜峰保留時(shí)間在29.59 min，兩者能夠基線分離。

2.3 供試品溶液的制備 分別取金葉接骨木的葉和莖藥材，粉碎，過(guò)80目篩，60℃干燥至恒重。分別精密稱(chēng)取適量(相當(dāng)生藥0.5 g)，置200 ml具塞三角錐形瓶中，加入甲醇10 ml，超聲提取40 min，冷卻，過(guò)濾，濾液水浴蒸干，殘?jiān)眉状既芙獠⒍ㄈ葜?0 ml容量瓶中得金葉接骨木葉和莖藥材供試品溶液。

2.4 線性范圍考察 取稀釋后的齊墩果酸、熊果酸混合對(duì)照品溶液(齊墩果酸、熊果酸濃度分別為243.36 μg/ml，64.92 μg/ml)，分別稀釋1.5，2，3，4，10，20倍后按2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣檢測(cè)，以峰面積為橫坐標(biāo)，濃度為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸。從標(biāo)準(zhǔn)曲線圖中測(cè)得齊墩果酸回歸方程C=0.000 1A+3.440 5，r=0.999 9，表明齊墩果酸在 12.17 －243.36 μg/ml濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好;熊果酸回歸方程 C=4 ×10－5A+0.979 1，r=0.999 8，表明熊果酸在3.25 －64.92 μg/ml濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.5 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取同一金葉接骨木葉供試品溶液，分別于0，2，4，8，12，24 h 進(jìn)樣測(cè)定，考察其穩(wěn)定性。記錄峰面積，計(jì)算齊墩果酸和熊果酸峰面積的RSD分別為0.63%和0.81%。表明供試品溶液在24 h內(nèi)基本穩(wěn)定。

2.6 精密度試驗(yàn) 取同一金葉接骨木葉供試品溶液，連續(xù)進(jìn)樣6次，記錄峰面積，計(jì)算齊墩果酸和熊果酸峰面積的 RSD，RSD分別為1.05%和0.73%(n=6)。表明儀器精密度良好。

2.7 重復(fù)性試驗(yàn) 精密稱(chēng)定同一批金葉接骨木葉樣品，按2.2項(xiàng)下方法分別制備6份供試品溶液，按2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測(cè)定，記錄峰面積，分別按回歸方程計(jì)算齊墩果酸和熊果酸的含量。其RSD值分別為0.85%和1.42%(n=6)，表明此方法重復(fù)性良好。

2.8 加樣回收率 稱(chēng)取已知含量的金葉接骨木葉樣品6份，每份約0.5 g，準(zhǔn)確計(jì)算樣品中齊墩果酸和熊果酸的含量，分別加入適量齊墩果酸和熊果酸對(duì)照品溶液，按2.2項(xiàng)下方法制備供試品溶液，進(jìn)樣，結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 齊墩果酸和熊果酸加樣回收率的試驗(yàn)結(jié)果 (mg，n=6)Tab 1 The recovery results of oleanolic acid and ursolic acid (mg，n=6)

結(jié)果顯示，齊墩果酸和熊果酸的加樣回收率分別為 98.50%(RSD 為 3.03%)和 99.49%(RSD 為1.37%)，回收率良好。

2.9 樣品測(cè)定 分別取金葉接骨木葉和莖藥材粉末約0.5 g精密稱(chēng)定，按照2.3項(xiàng)下方法制備供試液，按2.1項(xiàng)下色譜條件分別取10 μl進(jìn)樣檢測(cè)，記錄金葉接骨木莖和葉的色譜圖和峰面積，見(jiàn)圖2，3。高效液相色譜法測(cè)得金葉接骨木莖和葉樣品中齊墩果酸與熊果酸含量，見(jiàn)表2。

3 討論

圖2 金葉接骨木莖供試液色譜圖Fig 2 The chromatogram of the test solution from the stem of Sambucus canadensis Aurea

圖3 金葉接骨木葉供試液色譜圖Fig 3 The chromatogram of the test solution from the leaves of Sambucus canadensis Aurea

表2 金葉接骨木莖和葉中齊墩果酸和熊果酸含量(mg/g)Tab 2 The contents of oleanolic acid and ursolic acid in the stem and the leaves of Sambucus canadensis Aurea(mg/g)

齊墩果酸與熊果酸均屬三萜類(lèi)化合物，結(jié)構(gòu)相似，其理化性質(zhì)相近，因而在色譜柱上的保留時(shí)間非常相近，如果柱效不高并且流動(dòng)相選擇不當(dāng)時(shí)，很難將其分開(kāi)。本實(shí)驗(yàn)采用HPLC法同時(shí)測(cè)定金葉接骨木莖葉中的這兩種成分時(shí)，采用調(diào)節(jié)流動(dòng)相的pH值，并加大流動(dòng)相中水的比例，可以有效地將兩者分開(kāi)。在2.1所述色譜條件下，取對(duì)照品溶液進(jìn)樣10 μl檢測(cè)，理論塔板數(shù)為5 000，齊墩果酸和熊果酸分離度為1.6。本法定量準(zhǔn)確，回收率高，并能同時(shí)測(cè)出齊墩果酸與熊果酸的含量，簡(jiǎn)單易行，可做為同時(shí)含有齊墩果酸與熊果酸植物的測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)。

金葉接骨木在我國(guó)多省區(qū)均有栽培，其枝繁葉茂，資源豐富，能否如接骨木屬植物一樣具有藥用價(jià)值，本次實(shí)驗(yàn)為進(jìn)一步開(kāi)發(fā)和利用其植物提供了一定的科學(xué)依據(jù)。

［1］ 曹兵，宋麗華，馬國(guó)彬，等.銀川地區(qū)14種綠化樹(shù)種的引種試驗(yàn)報(bào)告［J］.農(nóng)業(yè)科學(xué)研究，2007，28(3):72.

［2］ 陳武，李開(kāi)泉，熊筱娟，等.陸英抗肝炎活性成分的研究［J］.南昌大學(xué)學(xué)報(bào):理科版，2001，25(2):165 －167.

［3］ 趙淑紅，高亦瓏，徐力生，等.銀川引種金葉接骨木藥用價(jià)值初探［J］.寧夏醫(yī)學(xué)雜志，2010，32(1):58 －59.

［4］ 國(guó)家藥典委員會(huì).中華人民共和國(guó)藥典(2010年版1部)［M］.北京:中國(guó)醫(yī)藥科技出版社，2010:附錄28－30.

［5］ 鄒盛勤，陳武.地榆中烏索酸和齊墩果酸含量的高效液相色譜測(cè)定［J］.時(shí)珍國(guó)醫(yī)國(guó)藥，2006，17(8):1373 －1374.