李 珍,傅志泉,李春霞,周嘉鶴,胡甜甜

復方苦參注射液是由苦參、白茯苓及土茯苓等經(jīng)加工制成的純中藥制劑,臨床具有抑制腫瘤細胞生長、止痛、改善造血功能、增強化療效果等作用,其臨床報道較多,但有關作用于胃癌及其抗腫瘤作用機制研究卻相對不足。本研究以人胃癌BGC-823細胞為研究對象,觀察復方苦參注射液對其細胞增殖及凋亡的影響,探討其作用機制,以期為復方苦參注射液治療胃癌提供一定的實驗依據(jù)和理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料來源 人胃癌 BGC-823細胞購于中國醫(yī)學科學院上海細胞生物研究所細胞庫,其為貼壁型上皮細胞,建自于一位 62歲男性胃癌患者。

1.2 藥物及試劑 復方苦參注射液由山西振東醫(yī)藥集團生產(chǎn),國藥準字 Z14021231Z14021230,5 ml/支;RPMI-1640培養(yǎng)液及 DNA標準分子量 3 000 bp(DNA分子量別為 3 000 bp、2 000 bp、 1 000 bp、 750 bp、 500 bp、 250 bp、 100 bp)為杭州吉諾生物醫(yī)藥技術(shù)有限公司產(chǎn)品;胎牛血清為杭州四季青生物工程材料有限公司產(chǎn)品;噻唑蘭及二甲基亞砜 (DMSO)為Amresco分裝;PI試劑盒為美國 BD公司產(chǎn)品;公司瓊脂糖粉為 Agarose分裝;細胞凋亡 DNA-ladder提取試劑為北京博大泰克生物基因技術(shù)有限責任公司產(chǎn)品。

1.3 細胞培養(yǎng) 常規(guī)復蘇人胃癌 BGC-823細胞株,按貼壁方法培養(yǎng),細胞培養(yǎng)在經(jīng)過 0.22μm濾膜過濾的 RPMI-1640培養(yǎng)液中 (含 10%熱滅活血清,青霉素 100 U/ml和鏈霉素100μg/ml),在 37℃、5%的 CO2、飽和濕度下進行培養(yǎng),用PBS配制的 0.15%的胰蛋白酶 (含有 0.02%的 EDTA)消化細胞傳代,每周可以傳代1～2次,收集指數(shù)生長期 BGC-823細胞用于實驗研究。

1.4 四甲基偶氮唑藍 (MTT)比色法測定細胞增殖抑制率實驗用 96孔培養(yǎng)板內(nèi)加入 5×104個/ml的單細胞懸液,每孔加入 20μl培養(yǎng)液,37℃、5%CO2孵箱中培養(yǎng) 24 h,加入終濃度分別為原液濃度 1/200.0、1/100.0、1/50.0、1/25.0及1/12.5的復方苦參注射液作用于人胃癌 BGC-823細胞,每一濃度設 6個復孔,對照組加入等體積的無血清 RPMI-1640培養(yǎng)液,繼續(xù)培養(yǎng) 48 h后,1 000 r/min,10 min,棄去上清,每孔加入無血清 RPMI-1640培養(yǎng)液 200μl,每孔再加入 MTT(5 mg/ml)20μl,繼續(xù)孵育 4 h,離心去上清,每孔加入 DMSO200μl,同時設 DMSO空白對照,6個復孔。振蕩溶解結(jié)晶,在 570 nm波長比色 (Wallac酶標儀),實驗重復 3次,取平均值為最終結(jié)果。按下列公式計算抑制率:細胞抑制率 =[(對照組 OD值 570-給藥組 OD值 570)/(對照組 OD值570-本底組 OD值 570)] ×100%計算,并采用 Logit法計算出復方苦參注射液作用人胃癌BGC-823細胞48 h細胞生長抑制 50%,即 48 h半數(shù)抑制濃度 (IC50)值。

1.5 流式細胞儀檢測細胞凋亡 參照試劑盒說明書操作。人胃癌 BGC-823細胞以 5×105/ml的單細胞懸液接種 6孔培養(yǎng)板,加入復方苦參注射液 (終濃度為 1/25.0原液稀釋倍數(shù))作用人胃癌 BGC-823細胞 24 h、48 h及 72 h后,同時設空白對照組,收獲細胞,1 500 r/min,離心 5 min,冷 PBS洗 3次后棄上清液,用預冷75%乙醇固定,4℃保存。臨用前固定細胞懸液離心,加預冷 PBS2 ml,2 000 r/min,5 min,洗 2次,調(diào)整細胞濃度至 1×106/ml,加入 RNase A(10 mg/ml)100 μl混勻,室溫孵育 10 min,加入碘化丙啶染液 (PI,50μg/ml)800μl混勻,4℃避光放置 30 min后流式細胞儀檢測分析,CellQuest 3.3軟件獲取直方圖,MulticyCle軟件分析亞二倍體峰及細胞凋亡率。

1.6 細胞 DNA提取及瓊脂糖凝膠電泳 收集經(jīng)復方苦參注射液 (終濃度為1/25.0原液稀釋倍數(shù))作用 48 h及72 h后的及正常培養(yǎng)的人胃癌 BGC-823細胞各 1×106個,用細胞凋亡DNA Ladder提取試劑盒抽取細胞 DNA,嚴格按試劑盒提供步驟操作,取 10μl DNA樣品與上樣緩沖液混勻,于 2%瓊脂糖凝膠低電壓電泳 (1 V/cm),在紫外燈下觀察并記錄 DNA電泳情況。

1.7 統(tǒng)計學方法 采用 SPSS 13.0統(tǒng)計軟件進行處理,計量資料采用表示,采用 t檢驗;相關指標用 one-way ANOVA分析,以p＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 MTT比色法測定細胞增殖抑制率 不同濃度復方苦參注射液對人胃癌 BGC-823細胞48 h生長抑制率比較,差異有統(tǒng)計學意義 (p＜0.05,見表1)。復方苦參注射液能明顯抑制人胃癌 BGC-823細胞生長,且有濃度依賴關系。IC50為 9/250原液稀釋倍數(shù)。

表 1 復方苦參注射液對人胃癌 BGC-823細胞 48 h生長抑制作用Table 1 CRSFI on the human gastric cancer BGC-823 cell proliferation for 48 hours

表 1 復方苦參注射液對人胃癌 BGC-823細胞 48 h生長抑制作用Table 1 CRSFI on the human gastric cancer BGC-823 cell proliferation for 48 hours

組別 藥物濃度 (劑量/原液稀釋倍數(shù)) 抑制率 (%)對照組 0 0復方苦參注射液 1組 1/200.0 10.74±2.51復方苦參注射液 2組 1/100.0 19.13±4.78復方苦參注射液 3組 1/50.0 44.12±3.99復方苦參注射液 4組 1/25.0 54.19±2.18復方苦參注射液 5組 1/12.5 65.13±2.72

2.2 流式細胞儀檢測細胞凋亡率 凋亡細胞的 DNA熒光強度降低,在 G0/G1峰前出現(xiàn)一個小于 DNA二倍體含量的亞二倍體峰,即細胞凋亡峰 (Sub-G1)。加入復方苦參注射液 (終濃度為 1/25.0原液稀釋倍數(shù))作用人胃癌 BGC-823細胞 24 h、48 h及 72 h,PI染色流式細胞儀檢測其細胞凋亡率分別為(9.58±0.88)%、(20.41±0.77)%及 (60.30±3.19)%,空白對照組為 (4.17±0.11)%,各組與對照組比較差異均有統(tǒng)計學意義 (p＜0.05),并出現(xiàn)明顯的 Sub-G1(見圖1)。

圖 1 復方苦參注射液作用于人胃癌 BGC-823細胞PI染色細胞凋亡率Figure 1 CRSFI on the human gastric cancer BGC-823 cell apoptosis rate of PI

2.3 細胞 DNA提取及瓊脂糖凝膠電泳 復方苦參注射液 (終濃度為 1/25.0原液稀釋倍數(shù))作用于人胃癌 BGC-823細胞48 h及72 h后,抽提 DNA,在瓊脂糖凝膠電泳可見 DNA斷裂成 180～200 bp及其倍數(shù)的片斷梯形條帶,空白對照則未見此現(xiàn)象 (見圖 2)。

圖 2 復方苦參注射液作用于人胃癌 BGC-823細胞 DNA瓊脂糖凝膠電泳Figur e 2 CRSFI on the human gastric cancer BGC-823 cell agarose gel electrophoresis of DNA

3 討論

胃癌是人類常見的惡性腫瘤,我國是胃癌高發(fā)國家,其發(fā)病率和死亡率居各種惡性腫瘤首位[1],嚴重威脅著人類的健康,因此對其防治的研究具有重要的臨床意義?，F(xiàn)代醫(yī)學研究表明,細胞過度增殖與凋亡的阻遏是腫瘤的基本特征,隨著基因研究的深入,已經(jīng)證實胃癌發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)移、血管生成、耐藥性和預后等都與細胞凋亡有一定關系。因而抗腫瘤藥物的作用途徑之一就是誘導腫瘤細胞凋亡。

復方苦參注射液是以苦參、白茯苓和土茯苓等為原料經(jīng)科學提煉而制成的注射劑,其主要有效成分為氧化苦參堿、槐定堿、苦參堿等[2-3],苦參清熱燥濕,茯苓清熱解毒。實驗研究證明復方苦參注射液及其成分苦參堿、氧化苦參堿等對多種腫瘤細胞如 SGC7901、HepG2和 BEL27402等有直接殺傷作用[4]。該藥在實驗研究及臨床應用中被發(fā)現(xiàn)具有良好的抑制腫瘤的作用,其對肺癌、肝癌、胃癌等腫瘤細胞增殖均有抑制作用,聯(lián)合化療可減毒增效,提高臨床抗腫瘤的療效[5-8]。

本研究結(jié)果表明,復方苦參注射液對人胃癌 BGC-823細胞具有明顯的增殖抑制作用,呈現(xiàn)量效關系。通過流式細胞儀檢測分析,復方苦參注射液作用人胃 BGC-823細胞 24 h、48 h及 72 h后,凋亡細胞百分數(shù)逐漸增多并出現(xiàn)明顯的 Sub-G1,且 DNA瓊脂糖凝膠電泳出現(xiàn)明顯的梯狀條帶,這種典型改變是細胞凋亡的可靠指標,可見復方苦參注射液能夠抑制胃癌 BGC-823細胞增殖并誘導其凋亡,其具體作用機制還有待于進一步研究,以期為復方苦參注射液應用于臨床治療胃癌提供一定的實驗依據(jù)和理論基礎。

1 孫秀娣,牧人,周有尚,等.中國胃癌死亡率 20年變化情況分析及其發(fā)展趨勢預測 [J].中華腫瘤雜志,2004,26(1):4-9.

2 田娟,王維皓,高慧敏,等.HPLC測定復方苦參注射液中苦參堿、槐定堿和氧化苦參堿的含量 [J].中國中藥雜志,2007,32(3):222-224.

3 吳迪,梁健,廉建偉,等.RP-HPLC法同時測定復方苦參注射液中氧化槐果堿、氧化苦參堿和苦參堿的含量 [J].沈陽藥科大學學報,2006,23(4):220-223.

4 李芮,杜健鵬,侯仰韶,等 .復方苦參注射液對 SGC27901,HepG2和BEL27402腫瘤細胞作用的實驗研究 [J].腫瘤研究與臨床,2006,18(1):8-10.

5 高平,陳秀珍,張玉香,等.復方苦參注射液治療晚期腫瘤 300例[J].中醫(yī)雜志,2001,42(6):378.

6 陳堅,梅琪,徐迎春,等.復方苦參注射液對惡性腫瘤患者伽瑪?shù)斗派渲委熀?T淋巴細胞亞群的影響 [J].中西醫(yī)結(jié)合學報,2006,4(1):78-79.

7 林麗珠,周岱翰,陳瑤,等 .復方苦參注射液對肺癌和肝癌細胞抑瘤作用研究 [J].中藥新藥與臨床藥理,2009,20(1):21-23.

8 許進秀,陳澤濤,王愛榮,等.巖舒注射液誘導胃癌SGC-7901細胞凋亡及其機制 [J].中華腫瘤防治雜志,2007,14(16):1210-1214.