熊正文,李永申,李 偉,李宏偉,黃 勇,張華東,尋鳳華

上皮 -間質(zhì)轉(zhuǎn)化 (epithelial-mesenchymal transition,EMT)是多細(xì)胞生物胚胎發(fā)生的基礎(chǔ)過程,在胚胎發(fā)育早期較為多見,也存在于多種慢性疾病以及腫瘤的發(fā)生、發(fā)展過程中,它以上皮細(xì)胞極性喪失及其間質(zhì)特性的獲得為主要特征[1]。EMT在腫瘤的發(fā)生、浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移中扮演著重要角色[2],研究表明轉(zhuǎn)錄因子 Snail可促使 EMT的發(fā)生[3],其在乳腺癌、胃癌、結(jié)腸癌、肝癌、卵巢癌、頭頸部鱗狀細(xì)胞癌等多種腫瘤中呈高表達(dá)[4]。本研究采用原位分子雜交技術(shù)分別檢測(cè) Snail mRNA在乳腺浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌、乳腺導(dǎo)管內(nèi)癌及乳腺單純性增生組織中的表達(dá),旨在探討其與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展和浸潤(rùn)轉(zhuǎn)移的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 材料 收集經(jīng)臨床病理醫(yī)生診斷為乳腺單純?cè)錾?、乳腺?dǎo)管內(nèi)癌的組織標(biāo)本各 30例,乳腺浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌組織標(biāo)本 70例。70例乳腺浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌患者中腫瘤直徑 ＜2 cm者 9例,≥2 cm者 61例;局部腋窩淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移陰性者 21例,陽(yáng)性者49例。根據(jù) WHO的組織學(xué)分級(jí)標(biāo)準(zhǔn):Ⅰ級(jí) 15例,Ⅱ級(jí) 35例,Ⅲ級(jí) 20例。標(biāo)本均來(lái)自中國(guó)人民解放軍 251醫(yī)院病理科2008—2009年存檔的資料,患者年齡 22～75歲,平均 47歲,術(shù)前均未接受化療、激素治療及放療。組織標(biāo)本經(jīng) 10%甲醛溶液常規(guī)固定,石蠟包埋,連續(xù)切片 4μm,裱于經(jīng) APES處理的載玻片上,65℃烤箱烤片過夜,防止脫片。

1.2 試劑及其來(lái)源 Snail原位雜交試劑盒購(gòu)自武漢博士德生物工程有限公司 (MK2640-h),探針為針對(duì)人 Snail靶基因的 mRNA序列 (5'-AGAGTTTACCTTCCAGCAGCCCTACGACCAGGCCC-3';5'-AAGGCCTTCAACTGCAAATACTGCAA-CAAGGAATA-3';5'-TACCAGTGCCAGGCGTGTGCTCGGACCTTCTCCCG-3'),顯示系統(tǒng)為生物素化鼠抗地高辛和過氧化物酶標(biāo)記鏈霉卵白素 (SABC-POD),DAB顯色。

1.3 原位雜交 石蠟切片復(fù)溫,脫蠟至水。3%H2O2室溫下作用 10 min,蒸餾水洗 3次,3%檸檬酸稀釋的胃蛋白酶室溫下消化 30 min。1%的多聚甲醛室溫下固定 10 min,蒸餾水洗3次,每張切片滴加 20μl預(yù)雜交液,置濕盒中放入 40℃恒溫箱 4 h。滴加雜交液 20μl/片,置 38～42℃恒溫箱中過夜。37℃預(yù)溫的 2×SSC沖洗 5 min×3次,37℃預(yù)溫的 0.5×SSC沖洗 5 min×3次,37℃預(yù)溫的 0.2×SSC沖洗 5 min×3次。滴加封閉液,37℃30 min。滴加生物素化鼠抗地高辛,37℃60 min。滴加 SABC,37℃20 min。滴加生物素過氧化物酶,37℃20 min。DAB避光顯色,蘇木素復(fù)染、脫水、透明、中性樹膠封片,每批染色均用已知陽(yáng)性切片作為陽(yáng)性對(duì)照,用 PBS代替雜交液作為陰性對(duì)照。

1.4 結(jié)果判斷 Snail mRNA原位分子雜交陽(yáng)性信號(hào)為棕黃色顆粒,定位于細(xì)胞質(zhì)。每張切片選擇 10個(gè)高倍視野,按陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)占視野中總細(xì)胞數(shù)的百分比分為:無(wú)陽(yáng)性著色或陽(yáng)性細(xì)胞數(shù) ＜10%為陰性,陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)≥10%為陽(yáng)性[5]。1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 數(shù)據(jù)采用 SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件處理,采用χ2檢驗(yàn),以p＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 Snail mRNA在不同乳腺組織中的表達(dá) Snail mRNA原位分子雜交陽(yáng)性信號(hào)為棕黃色顆粒,定位于細(xì)胞質(zhì)。70例乳腺浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌組織中 Snail mRNA陽(yáng)性率為 81.4%(57/70),30例乳腺導(dǎo)管內(nèi)癌組織中 Snail mRNA陽(yáng)性率為 46.7%(14/30),30例乳腺單純性增生組織中 Snail mRNA陽(yáng)性率為23.3%(7/30),三者比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (χ2=32.4,p＜0.01)。乳腺浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌組織中 Snail mRNA陽(yáng)性率分別高于乳腺導(dǎo)管內(nèi)癌組織和乳腺單純性增生組織中的陽(yáng)性率,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (χ2值分別為 12.3和 30.8,p＜0.01)。Snail mRNA的表達(dá)水平隨著乳腺單純性增生、乳腺導(dǎo)管內(nèi)癌、乳腺浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌變化而呈現(xiàn)增高的趨勢(shì) (見圖 1～4)。

圖 1 乳腺單純性增生組織中 Snail mRNA陽(yáng)性表達(dá) (ISH法, ×200)Figur e 1 The positive expression of Snail mRNA in simplex breast hyperplasia

圖 2 乳腺導(dǎo)管內(nèi)癌組織中 Snail mRNA陽(yáng)性表達(dá) (ISH法, ×200)Figur e 2 The positive expression of Snail mRNA in intraductal breast cancer

圖 3 乳腺浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌組織 Snail mRNA弱陽(yáng)性表達(dá) (ISH法, ×100)Figur e 3 The poor positive expression of Snail mRNA in invasive ductal breast cancer

圖 4 乳腺浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌組織 Snail mRNA強(qiáng)陽(yáng)性表達(dá) (ISH法,×200)Figur e 4 The strong positive expression of Snail mRNA in invasive ductal breast cancer

2.2 Snail mRNA的表達(dá)與乳腺癌患者臨床病理特征的關(guān)系有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者與無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者相比,Snail mRNA陽(yáng)性率間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P=0.004);而不同年齡、腫瘤直徑、組織學(xué)分級(jí)者的 Snail mRNA陽(yáng)性率比較,差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P＞0.05,見表 1)。

表 1 Snail mRNA表達(dá)與臨床病理特征之間的關(guān)系Table 1 The relationship between the expression of Snail mRNA and clinicopathologic feature

3 討論

3.1 Snail mRNA在不同乳腺疾病中的表達(dá)情況 Snail基因定位于人類染色體20q13.13,Snail/Slug都屬于鋅指蛋白 Snail超家族,它們通過與 Smad相互作用蛋白 (Smad-interacting protein-1,SIP1)競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合 E-cadherin啟動(dòng)子區(qū)的 E-box序列,抑制 E-cadherin、occludin等的表達(dá),上調(diào) FSP1、vimentin和 Rho等的表達(dá),從而誘導(dǎo) EMT的發(fā)生,提高細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移能力,所以 Snail可以被看作腫瘤轉(zhuǎn)移的促進(jìn)因素[6]。本研究結(jié)果顯示,隨著病變程度加重,Snail mRNA的陽(yáng)性率明顯增高,這提示 Snail mRNA的高表達(dá)在乳腺癌的發(fā)生、發(fā)展中可能起著十分重要的作用,這與 Lee等[7]對(duì)宮頸癌的研究結(jié)果基本一致。

3.2 Snail mRNA在乳腺浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌組織中的表達(dá)及其與臨床病理特征的關(guān)系 近年 Snail在 EMT與腫瘤轉(zhuǎn)移中的作用越來(lái)越受到人們的關(guān)注,Snail mRNA在多種腫瘤中均有表達(dá),此外,對(duì)人類腫瘤標(biāo)本進(jìn)行免疫組化檢測(cè)表明,Snail蛋白高表達(dá)于乳腺癌、卵巢癌、結(jié)直腸癌、食管癌等,并與腫瘤的轉(zhuǎn)移和組織學(xué)分級(jí)密切相關(guān)[8]。吳繼鋒等[9]采用原位分子雜交技術(shù)檢測(cè)胃癌組織及癌旁組織 Snail mRNA的表達(dá),結(jié)果顯示Snail mRNA表達(dá)與胃癌的組織分化、臨床分期及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移呈正相關(guān),而與患者的年齡、性別、腫瘤大小均無(wú)關(guān)。Come等[10]研究發(fā)現(xiàn) Snail主要表達(dá)于乳腺癌組織的細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì),相應(yīng)正常組織往往缺如,且與乳腺癌的組織分級(jí)、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移狀況密切相關(guān),細(xì)胞核中 Snail的表達(dá)與乳腺癌的高級(jí)別和增殖活性有關(guān),但與腫瘤復(fù)發(fā)無(wú)關(guān)。Lundgren等[11]通過體外研究發(fā)現(xiàn),Snail蛋白的過表達(dá)能夠增強(qiáng)乳腺癌細(xì)胞株 MCF-7、T-47D和 MDA-MB-468的移動(dòng)性,而不表達(dá) Snail蛋白的細(xì)胞株 MFC-7、MDA-MB-468和 MDA-MB-231的移動(dòng)性則降低。本研究發(fā)現(xiàn) 70例乳腺浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌組織中Snail mRNA陽(yáng)性率為 81.4%,其中Ⅲ級(jí)者較Ⅰ、Ⅱ級(jí)者,有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者較無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者 Snail mRNA的陽(yáng)性率均明顯增高,但 Snail mRNA陽(yáng)性率與患者的性別和腫瘤大小均無(wú)關(guān),這與文獻(xiàn)報(bào)道的基本一致[8-11]。Snail mRNA在高級(jí)別、有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的組織中,其陽(yáng)性表達(dá)率均明顯增強(qiáng),提示 Snail mRNA在腫瘤中的表達(dá)越高,癌細(xì)胞的生存能力和腫瘤的惡性程度可能也隨之增高,癌細(xì)胞更容易侵襲周圍組織并發(fā)生轉(zhuǎn)移,即 Snail mRNA的高表達(dá)可能預(yù)示預(yù)后不良。

3.3 Snail與 EMT EMT是指在某些特殊的生理或病理?xiàng)l件下,具有極性的上皮細(xì)胞失去極性,轉(zhuǎn)換成具有活動(dòng)能力、能夠在細(xì)胞基質(zhì)間自由移動(dòng)的間質(zhì)細(xì)胞的過程[12]。在 EMT過程中,細(xì)胞的功能發(fā)生了變化,與相鄰的細(xì)胞分離,遷移到鄰近的組織,其主要分子特征如 E-鈣黏素、角蛋白等上皮標(biāo)記物表達(dá)下調(diào)和 N-鈣黏素、波形蛋白等間質(zhì)標(biāo)記物表達(dá)上調(diào)[13]。有研究發(fā)現(xiàn),轉(zhuǎn)錄因子 Snail通過與上皮鈣黏附分子 E-cadherin啟動(dòng)子區(qū)結(jié)合而轉(zhuǎn)錄抑制 E-cadherin的表達(dá),從而誘導(dǎo)EMT的發(fā)生[14]。本研究結(jié)果表明,Snail mRNA在乳腺浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌中的表達(dá)顯著高于在乳腺單純性增生和乳腺導(dǎo)管內(nèi)癌中的表達(dá),提示 Snail mRNA在腫瘤組織中的表達(dá)是一個(gè)漸進(jìn)的過程,隨著癌前細(xì)胞向癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)化,Snail mRNA的表達(dá)逐漸增高,這說(shuō)明了 Snail可能促進(jìn)了乳腺正常上皮細(xì)胞間質(zhì)化轉(zhuǎn)變,提高了乳腺癌侵襲轉(zhuǎn)移潛能,從而為乳腺癌轉(zhuǎn)移分子機(jī)制提供了理論證據(jù),并為其靶向逆轉(zhuǎn)提供了參考靶點(diǎn)。腫瘤的發(fā)生、發(fā)展過程受多種因素的影響,是多種基因相互協(xié)調(diào)、相互作用的結(jié)果。EMT與腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移之間存在著復(fù)雜的調(diào)控機(jī)制,不僅與 Snail的表達(dá)有關(guān),可能還與其他許多信號(hào)分子表達(dá)有關(guān),有待進(jìn)一步深入研究。

綜上所述,Snail mRNA在乳腺浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌組織的表達(dá)高于乳腺單純性增生和乳腺導(dǎo)管內(nèi)癌組織的表達(dá),可能對(duì)乳腺癌的發(fā)生、發(fā)展及轉(zhuǎn)移起到促進(jìn)作用。研究證實(shí)拮抗 Snail的作用可使癌細(xì)胞體外轉(zhuǎn)移的潛能下降[15]。推測(cè) Snail可能作為轉(zhuǎn)錄因子,居于信號(hào)通路級(jí)聯(lián)反應(yīng)的中心環(huán)節(jié),對(duì)其上游信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路以及下游 Snail轉(zhuǎn)錄調(diào)控基因進(jìn)行調(diào)控,通過阻斷Snail信號(hào)途徑,進(jìn)而采取針對(duì) Snail的干預(yù)方案,有望降低乳腺癌的惡性程度及浸潤(rùn)轉(zhuǎn)移率,從而改善患者的預(yù)后。同時(shí)Snail還有可能作為腫瘤轉(zhuǎn)移潛能的標(biāo)志物,這將會(huì)促進(jìn)腫瘤治療新方案的研究,對(duì)提高患者的生存率起積極作用。

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