張永正，王玉，閔海，馬麗雅

原發(fā)性高血壓(essential hypertension，EH)是遺傳因素與環(huán)境共同作用的多基因遺傳病，具有高度遺傳異質(zhì)性、遲顯性和易感基因外顯不全性，這為確定EH相關(guān)基因的研究帶來(lái)極大困難。EH候選基的研究一直受到科研人員的重視，其中種族與EH的關(guān)系很早就被關(guān)注。研究表明內(nèi)皮一氧化氮合酶(eNOS)是左旋精氨酸一氧化氮途徑的關(guān)鍵酶，eNOS催化合成的一氧化氮具有擴(kuò)血管、調(diào)節(jié)血流、阻止腎素-血管緊張素的產(chǎn)生、抑制血管平滑肌細(xì)胞增殖、抑制血小板聚集、黏附和白細(xì)胞趨化作用［1］，eNOS基因第7個(gè)外顯子的突變即894位堿基G變成T(G894T)導(dǎo)致GLU298ASP的錯(cuò)譯，此突變影響eNOS酶表達(dá)，使NO生成減少，導(dǎo)致血管緊張素增加，內(nèi)皮受損，血管收縮障礙導(dǎo)致血壓升高。有效控制血壓是降低心血管疾病患病率和病死率的關(guān)鍵，臨床觀察發(fā)現(xiàn)不同個(gè)體對(duì)同一降壓藥物的反應(yīng)性存在差異，這種差異不能完全用年齡、性別、疾病、用藥等來(lái)解釋。這提示抗高血壓藥物對(duì)原發(fā)性高血壓患者降壓療效的個(gè)體差異可能與不同個(gè)體的遺傳異質(zhì)性相關(guān)。進(jìn)一步研究顯示G894T多態(tài)性中T等位基因可能是治療反應(yīng)的預(yù)測(cè)因素［2］。本研究對(duì)甘肅臨夏州東鄉(xiāng)族270例原發(fā)性高血壓患者應(yīng)用替米沙坦進(jìn)行治療，旨在探討其降壓療效與內(nèi)皮型一氧化氮合酶(eNOS)基因G894T多態(tài)性的相關(guān)性，及對(duì)高血壓并糖尿病患者糖脂代謝的影響。

1 資料和方法

1.1 研究對(duì)象 選取2007年6月至2009年3月在甘肅省臨夏州人民醫(yī)院心內(nèi)科住院及門診患者，均為長(zhǎng)期生活在當(dāng)?shù)責(zé)o三代以內(nèi)血緣關(guān)系的東鄉(xiāng)族高血壓患者，共270例，其中男性189例，女性81例，年齡(55.82±8.31)歲，以2005年《中國(guó)高血壓防治指南》為高血壓患者納入標(biāo)準(zhǔn)［3］，排除繼發(fā)性高血壓、心肌病、瓣膜疾病、先天性心臟病及腎功能衰竭者。選出符合條件的40例高血壓合并糖尿病患者。糖尿病入選標(biāo)準(zhǔn)符合糖尿病診斷標(biāo)準(zhǔn):按空腹血糖＞7.0 mmol/L，餐后血糖 ＞11.1 mmol/L，排除嚴(yán)重肝腎功能不全，血肌酐 ＞180 μmol/L，繼發(fā)性高血壓，糖尿病腎病及應(yīng)用胰島素治療患者。該40例患者采用飲食，運(yùn)動(dòng)，口服藥物(二甲雙胍、拜糖平)等綜合手段血糖控制在合理范圍內(nèi)。對(duì)受試對(duì)象均簽署知情同意書，經(jīng)2周安慰劑洗脫，均進(jìn)入試驗(yàn)程序。

1.2 方法

1.2.1 實(shí)驗(yàn)前測(cè)定臨床指標(biāo) 調(diào)查時(shí)測(cè)量身高、體重、體重指數(shù)(BMI)、血壓及空腹靜脈血，檢測(cè)空腹血糖、甘油三酯(TG)、總膽固醇(TC)、高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)、低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)、血尿酸。

1.2.2 給藥過(guò)程 入選270例患者每日早8時(shí)口服替米沙坦40 mg，治療4周。4周后測(cè)量血壓，其中40例糖尿病患者繼續(xù)治療至第10周后檢測(cè)空腹血糖、TG、TC、HDL-C、LDL-C、血尿酸。

1.2.3 DNA的提取 采用血液基因組DNA小量抽提試劑盒(上海生工血液基因組DNA小量抽提試劑盒)抽提基因組DNA。

1.2.4 PCR擴(kuò)增 PCR引物:上游引物:LotNO.AW60599.5＇-AAGGCAGGAGACAGTGGATGGA-3＇;下游引 物:Lot NO.AW60600.5 ＇-CCCAGTCAATCCCTTTGGTGCTCA-3＇(上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成)。PCR反應(yīng)體系(50 μL反應(yīng)體系):(廣東東盛生物科技有限公司)，經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳，EB染色，紫外燈下觀察結(jié)果并照相(圖1)。

圖1 eNOS基因G894T特異性PCR產(chǎn)物電泳圖

1.2.5 基因型的檢測(cè) 酶切反應(yīng)體系15 μL，限制性內(nèi)切酶 BanⅡ0.5 μL(Promega Corporation Lot238827)，10× REBuffer 1.5 μL，BSA 0.15 μL，PCR 產(chǎn)物 10 μL，滅菌去離子雙蒸水定容至15 μL?；靹蚝箅x心30 s，置37℃電熱水浴箱水浴8 h。產(chǎn)物用3%瓊脂糖凝膠電泳，穩(wěn)壓電泳，100 V電壓，電泳45 min，EB染色，紫外燈下觀察結(jié)果并照相。

1.2.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件包，進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。對(duì)研究對(duì)象的基因型進(jìn)行Hardy-Weinberg平衡檢驗(yàn)，基因型、等位基因頻率和組間計(jì)數(shù)資料間比較采用χ2檢驗(yàn)，計(jì)量資料結(jié)果以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示，兩組均數(shù)間比較采用t檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 eNOS基因G894T多態(tài)性分析(圖2) 受檢者DNA經(jīng)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物為248 bp片段。G等位基因存在酶切位點(diǎn)，而T等位基因沒(méi)有酶切位點(diǎn)。若在此片段中不存在894G→T位點(diǎn)突變，即:基因型為GG純合子，出現(xiàn)限制性內(nèi)切酶BanⅡ的酶切位點(diǎn)，酶切后得到大小為163 bp和85 bp兩個(gè)長(zhǎng)度片段;含有894G→T點(diǎn)突變的純合子，即TT基因型，不能被限制性內(nèi)切酶BanⅡ切開(kāi)，仍為一大小248 bp的長(zhǎng)度片段;含有894 G→T點(diǎn)突變的雜合子基因型為GT型，酶切后既出現(xiàn)248 bp，又出現(xiàn)163 bp和85 bp長(zhǎng)度片段。

2.2 高血壓患者基因型分布及頻率 基因分型表明，高血壓患者eNOS基因G894T存在GG純合、TT純合和GT雜合3種基因型。完成該實(shí)驗(yàn)的270例患者中，GG基因型201例，GT基因型為61例，TT基因型為 8例，基因型頻率分別為 74.44%、22.59%、2.97%，G 等位基因頻率為 85.71%，T 等位基因頻率為14.29%。把等位基因頻帶入H-W公式 p+q=1，p2+2pq+q2=1，符合 Hardy-Weinberg平衡檢驗(yàn)。即:所選樣本具有群體代表性。

圖2 eNOS基因G894T特異性PCR產(chǎn)物酶切后電泳圖

2.3 各生化及臨床指標(biāo)的基線水平 隨機(jī)入選270例高血壓患者。受試者各生化及臨床指標(biāo)基線水平(表1)，根據(jù)GG純合、TT純合和GT雜合3種基因型，分為GG組及GT+TT組，經(jīng)檢驗(yàn)兩組間年齡性別相匹配，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均＞0.05);兩組間血糖、TG、TC相比，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均＞0.05);兩組間收縮壓(SBP)、舒張壓(DBP)基線水平比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均＞0.05);兩組間體重指數(shù)(BMI)比較，GT+TT組高于GG組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P ＜0.05)。

表1 GG組和GT+TT組臨床基本特征

2.4 eNOS基因G894T不同基因型組應(yīng)用替米沙坦前后血壓變化 兩組患者治療4周后的SBP、DBP均比治療前明顯下降(P＜0.05)。GG基因型組SBP下降幅度(13.6±6.6)mm Hg大于 GT+TT基因型組 SBP下降幅度(9.2±5.7)mm Hg，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。GG基因型組DBP下降幅度(11.4±4.3)mm Hg＞GT+TT 基因型組 DBP 下降幅度(8.5 ±4.4)mm Hg，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P ＜0.05)(表2、表3)。

表2 GG組和GT+TT組治療前后血壓對(duì)比(±s)

表2 GG組和GT+TT組治療前后血壓對(duì)比(±s)

注:與治療前同類血壓相比，aP＜0.05

項(xiàng)目 GG組(n=201)GT+TT組(n=69)164.2 ±13.9 165.5 ±14.2治療前舒張壓(mm Hg) 96.7 ±11.2 97.2 ±10.5治療后收縮壓(mm Hg) 150.6 ±10.4a 156.2 ±12.3a治療后舒張壓(mm Hg) 85.2 ±9.5a 88.7 ±10.1治療前收縮壓(mm Hg)a

表3 GG組和GT+TT組治療前后血壓降幅對(duì)比

2.5 替米沙坦治療前后血糖、血脂、血尿酸的變化選取40例高血壓合并糖尿病患者，其中GG基因型29例，GT基因型10例，TT基因型1例，經(jīng)替米沙坦治療后 TG，TC，空腹血糖，LDL-C，HDL-C，血尿酸，均顯著降低(P＜0.01)(表4)，因病例數(shù)少未作基因組間比較。

表4 替米沙坦治療前后血糖、血脂、血尿酸變化表(±s)

表4 替米沙坦治療前后血糖、血脂、血尿酸變化表(±s)

注:TG:甘油三酯;TC:總膽固醇;LDL-C:低密度脂蛋白膽固醇;HDL-C:高密度脂蛋白膽固醇;與治療前相比，aP＜0.01

項(xiàng)目 治療前 治療后TG(mmol/L) 2.21 ±1.02 1.71 ±0.63a TC(mmol/L) 5.38 ±1.31 4.84 ±0.87a空腹血糖(mmol/L) 6.77 ±1.07 6.36 ±0.78a LDL-C(mmol/L) 2.93 ±0.92 2.53 ±0.65a HDL-C(mmol/L) 1.20 ±0.25 1.38 ±0.23a血尿酸(umol/L) 446.56 ±110.56 378.52 ±78.95a

3 討論

替米沙坦是一個(gè)非肽類血管緊張素Ⅱ(AngⅡ)受體拮抗劑，通過(guò)在AT1受體水平特異阻斷血管緊張素系統(tǒng)而同時(shí)阻斷了由經(jīng)典途徑(腎素-血管緊張素系統(tǒng))及非經(jīng)典途徑產(chǎn)生的AngⅡ的作用，降壓效果更好，對(duì)其他激素?zé)o影響，且清除半衰期為24 h決定了降壓療效較持久［4］。

本研究選取甘肅省東鄉(xiāng)族人群作為研究對(duì)象，該民族的祖先主要是13世紀(jì)以后從中亞和西亞等地遷徙而來(lái)的撒爾塔人，有自己的語(yǔ)言和獨(dú)特的生活習(xí)慣，全民信奉伊斯蘭教。東鄉(xiāng)族人群生活相對(duì)封閉，主要聚居在甘肅省臨夏回族自治州東鄉(xiāng)族自治縣。影響血壓的環(huán)境因素:如生存環(huán)境、生活方式、飲食習(xí)慣和精神壓力等均較為一致，所選270例高血壓患者均為首診患者，減少了影響統(tǒng)計(jì)結(jié)果的混雜因素。

研究表明人類eNOS基因位于染色體7q35-36，全長(zhǎng)21 kb，有26個(gè)外顯子，25個(gè)內(nèi)含子，現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)其基因存在近10個(gè)多態(tài)性位點(diǎn)，其中894位點(diǎn)堿基G被T所取代，導(dǎo)致編碼產(chǎn)物第298號(hào)氨基酸由GLU變?yōu)锳SP，進(jìn)而影響NO合成，參與高血壓的發(fā)生和發(fā)展［2］。目前有研究證實(shí)eNOS基因該位點(diǎn)多態(tài)性與高血壓發(fā)病，以及治療耐藥有相關(guān)性［5］，因此被認(rèn)為是一種功能突變。進(jìn)一步的研究顯示，高血壓患者eNOS基因G894T多態(tài)性可能是患者對(duì)降壓治療敏感性不同因之一，在難治性高血壓病例中，T等位基因頻率較高［2］。Juchymova 等［2］研究了波西米亞地區(qū)的高加索人群中85例正常對(duì)照者和119例高血壓患者，發(fā)現(xiàn)eNOS的GLU298ASP多態(tài)性可能是患者對(duì)傳統(tǒng)降壓治療的抵抗因素之一。

本研究顯示，270例東鄉(xiāng)族原發(fā)性高血壓患者中兩組間血糖、TG、TC等生化指標(biāo)相比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。GT+TT組 SBP、DBP高于GG組，BMI明顯高于GG組，而且P＜0.05，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。這提示eNOS基因G894T多態(tài)性T等位基因變異與BMI升高之間的交互作用對(duì)高血壓的發(fā)病可能有一定作用。Benjafield等［6］研究顯示，G894T變異者BMI可顯著升高且存在劑量-反應(yīng)關(guān)系，與本研究結(jié)論相一致。Lapu等［7］在中國(guó)重慶對(duì)eNOS G894T多態(tài)性的研究結(jié)果是，eNOS不直接導(dǎo)致高血壓，但可能通過(guò)與其他危險(xiǎn)因子起到升高血壓的作用。王叢等［8］對(duì)內(nèi)蒙古地區(qū)蒙古族的研究認(rèn)為，G894T多態(tài)性是高血壓病的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，提示EH易感基因的作用可能具有地域性，而新疆哈薩克族e(cuò)NOS基因G894T多態(tài)性與EH不相關(guān)［9］。本研究在用藥4周后SBP、DBP均比治療前有明顯下降(P＜0.05)，這提示患者對(duì)替米沙坦的降壓作用反應(yīng)良好;而且GG基因型組SBP和DBP的下降幅度均大于GT+TT基因型組的下降幅度，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，提示G等位基因攜帶者對(duì)替米沙坦的降壓療效優(yōu)于T等位基因攜帶者。這與Jachymova和國(guó)內(nèi)狄群等［2，10］的研究相一致。但與王琳［11］和 Khawaja等［12］的研究有不同之處。出現(xiàn)上述差異可能與種族，遺傳有關(guān)［13］，遺傳環(huán)境和生活習(xí)慣相互作用可能是結(jié)論不一致的原因之一。因此eNOS基因多態(tài)性對(duì)不同患者降壓藥物的選擇具有指導(dǎo)意義，本研究發(fā)現(xiàn)替米沙坦對(duì)GG基因型的降壓療效明顯強(qiáng)于GT+TT基因型，說(shuō)明替米沙坦療效與T等位基因有關(guān)。

本研究亞組分析也看到了替米沙坦對(duì)代謝綜合征患者糖脂代謝的影響，在應(yīng)用替米沙坦治療10周后患者血糖、TG、TC、LDL-C、血尿酸均較治療前明顯下降，而HDL-C升高(P＜0.01)。替米沙坦是新一代ARBs，降壓安全有效，并且替米沙坦與胰島素增敏劑吡格列酮的化學(xué)結(jié)構(gòu)相似，有選擇性激動(dòng)PPAR-γ(過(guò)氧化物酶增殖體活性受體γ)的作用，因而推測(cè)其有減輕胰島素抵抗改善糖脂代謝的作用，基礎(chǔ)研究證實(shí)替米沙坦對(duì)胰島素抵抗大鼠可改善胰島素敏感性［14-15］。替米沙坦除了能夠增強(qiáng)胰島素敏感性外，還可以改善動(dòng)脈粥樣硬化的多種致病決定因子，如增加脂聯(lián)素水平，減少炎癥發(fā)生，降低氧化應(yīng)激等，體外研究顯示替米沙坦可以減少胰島素β細(xì)胞內(nèi)脂肪酸誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激和NADPH氧化還原酶活性，從而證實(shí)替米沙坦有保護(hù)胰島β細(xì)胞的作用［16］。PPRA-γ激活后可降低血漿游離脂肪酸水平，促進(jìn)葡萄糖進(jìn)入骨骼肌，抑制脂肪細(xì)胞表達(dá)和分泌腫瘤壞死因子，降低脂肪細(xì)胞分泌脂聯(lián)素，從而改善胰島素抵抗，降低血糖和改善血脂紊亂，起到胰島素增敏作用，并具有抗炎抗氧化及保護(hù)內(nèi)皮功能作用，本研究顯示在良好的降壓效果下，替米沙坦可以改善高血壓并糖尿病患者血糖及血脂水平。本研究中替米沙坦降低血糖、血脂的結(jié)果與陳遠(yuǎn)剛［17］和Negro等［18］在糖尿病合并高血壓人群應(yīng)用替米沙坦短期治療(10～12周)的結(jié)果是一致的。

本研究從分子生物學(xué)角度研究了eNOS基因G894T多態(tài)性與原發(fā)性高血壓利用藥物干預(yù)間的關(guān)系及對(duì)糖脂代謝的影響。顯示Glu298對(duì)替米沙坦治療反應(yīng)優(yōu)于Asp298，G等位基因攜帶者可能是臨床上選擇AngⅡ受體拮抗劑適應(yīng)者。這對(duì)有條件進(jìn)行基因甄別的高血壓患者有一定臨床指導(dǎo)意義。也顯示了替米沙坦在糖脂代謝方面其獨(dú)特的作用。但是，本研究的樣本量較小，候選基因單一，可能影響結(jié)論的準(zhǔn)確性;需擴(kuò)大樣本量并增加多個(gè)候選基因，進(jìn)行聯(lián)合研究分析后加以證實(shí)。

［1］ Burnier M，Maillard M.The comparative pharmacology of angiotensin Ⅱ receptor antagonists［J］.Blood Press，2001，1(1):6-11.

［2］ Jachymova M，Horky K，Bultas J，et al.Association of the Glu298 Asp polymorphism in the endothelial nitric oxide synthase gene with essential hypertension resistant to conventional therapy［J］.Biochem Biophys Res Commun，2001，284(2):426-430.

［3］中國(guó)高血壓防治指南起草委員會(huì).中國(guó)高血壓防治指南［M］.2005修訂版，北京:人民衛(wèi)生出版社，2005:18.

［4］ Kakuta H，Sudoh K，Sasamata M，et al.Telmisartan has the stron-gest binding affinity to angiotensinⅡtype 1 receptor:comparison with other angiotensin Ⅱ type 1 receptor blockers［J］.Int J Clin Pharmacol Res，2005，25(1):41-46.

［5］ Sandrim VC，Yugar-Toledo JC，Desta Z，et al.Endothelial nitric oxide synthase haplotypes are related to blood pressure elevation，but not to resistance to antihypertensive drug therapy［J］.J Hypertens，2006，24(12):2393-2397.

［6］ Benjafield AV，Morris BJ.Association analyses of endothelial nitric oxide synthase gene polymorphisms in essential hypertension［J］.Am J Hypertens，2000，13(9):994-998.

［7］ Lapu bula R，Quarshie A，Lyn D，et al.The 894T allele of endothelial nitric oxide synthase gene is related to left ventricular mass in African Americans with high-normal blood pressure［J］.J Natl Med Assoc，2005，97(2):197-205.

［8］王叢，孫剛，閆旭龍，等.蒙古族原發(fā)性高血壓患者a-adducin基因型和內(nèi)皮型一氧化氮合酶基因多態(tài)性研究［J］.臨床心血管病雜志，2007，23(7):525-527.

［9］徐新娟，汪師貞，林仁勇，等.新疆哈薩克族人群內(nèi)皮一氧化氮合酶基因與醛固酮合成酶基因協(xié)同作用與原發(fā)性高血壓的關(guān)聯(lián)性［J］.中國(guó)臨床康復(fù)，2006，10(20):13-15.

［10］狄群，占伊揚(yáng)，程蘊(yùn)琳，等.老年人群血管內(nèi)皮型一氧化氮合酶基因Glu298Asp多態(tài)性與原發(fā)性高血壓病的關(guān)系［J］.中國(guó)全科醫(yī)學(xué)，2002，5(5):355-357.

［11］王琳，陳丹，薛雨，等.內(nèi)皮型一氧化氮合酶基因Glu298Asp多態(tài)性與原發(fā)性高血壓的關(guān)系［J］.國(guó)際遺傳學(xué)雜志，2006，29(5):336-340.

［12］ Khawaja MR，Taj F，Ahmad U，et al.Association of endothelial nitric oxide synthase gene G894T polymorphism with essential hypertension in an adult Pakistani Pathan population［J］.Int J Cardiol，2007，2，116(1):116.

［13］ Li R，Lyn D，Lapu-Bula R，Oduwole A，et al.Relation of endothelial nitric oxide synthase gene to plasma nitric oxide level，endothelial function，and blood pressure in African Americans［J］.Am J Hypertens，2004，17(7):560-567.

［14］黃穎睿，劉暢.替米沙坦對(duì)胰島素抵抗大鼠脂肪細(xì)胞因子及胰島素敏感性的影響［J］.中國(guó)全科醫(yī)學(xué)，2009，12(8):632-634.

［15］李敏，吳學(xué)思.替米沙坦改善糖脂代謝的研究進(jìn)［J］.中國(guó)醫(yī)藥，2010，5(1):90-91.

［16］ Aitoh Y，Hongwei W，UenoH，et al.Telmisartan attenuates fattyacid-induced oxidative stress and NAD(P)H oxidase activity in pancreatic beta-cells［J］.Diabetes Metab，2009，35(5):392-397.

［17］陳遠(yuǎn)剛，陳明.替米沙坦對(duì)高血壓合并糖尿病患者血清脂聯(lián)素的影響［J］.中國(guó)動(dòng)脈硬化雜志，2008，16(6):492-494.

［18］ Negro R，Hassan H.The effects of telmisartan and amlodipine on metabolic parameters and blood pressure in type 2 diabetic，hypertensive patients［J］.J Renin Angiotensin Aldosterone Syst，2006，7(4):243-246.