和 梅,張 瑤,關(guān)雪蓮,侯立醇,張淑萍,張軍武,劉力學(xué),劉美玲

(1.佳木斯大學(xué)附屬第一醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科,黑龍江 佳木斯 154003;2.佳木斯大學(xué)研究生學(xué)院,黑龍江 佳木斯 154007)

癲癇是神經(jīng)系統(tǒng)中僅次于腦血管病的第二大疾病,我國(guó)約 600多萬(wàn)患者,其中 25%為難治性癲癇 ,目前主要有藥物和外科治療兩種手段,其效果均不理想?，F(xiàn)今神經(jīng)干細(xì)胞移植治療癲癇已是研究熱點(diǎn)。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)觀察紅景天苷、腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子(BDNF)聯(lián)合對(duì)體外海馬神經(jīng)干細(xì)胞(NSCs)向 r-氨基丁酸(GABA)能神經(jīng)元定向分化的影響及移植對(duì)致癇鼠的作用,為神經(jīng)干細(xì)胞進(jìn)一步研究及臨床應(yīng)用抗癲癇治療方法提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物及分組

新生 24h內(nèi) Wistar乳鼠 2只(佳木斯大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供),以培養(yǎng)傳 3代的神經(jīng)干細(xì)胞為材料設(shè)含 10%胎牛血清培養(yǎng)液為對(duì)照組、10%胎牛血清培養(yǎng)液分別加 BDNF、紅景天苷、BDN F和紅景天苷為實(shí)驗(yàn)組,培養(yǎng) 3d、7d、14d。紅景天苷最終濃度 10 μg/mL通過(guò)預(yù)實(shí)驗(yàn)得。健康的雄性 Wistar大鼠,體重為(220±20)kg;鼠齡 3～ 4個(gè)月(佳木斯大學(xué)動(dòng)物中心提供),給以戊四氮腹腔注射,制作大鼠癲癇模型,隨機(jī)選取造模成功的大鼠 72只分 3組:模型組;移植神經(jīng)干細(xì)胞組;移植神經(jīng)干細(xì)胞+BDNF+紅景天苷組。每組分為 7d、14d、21d、28d四個(gè)時(shí)間點(diǎn)進(jìn)行觀察,每個(gè)時(shí)間點(diǎn)為 6只大鼠。

1.2 試劑與儀器

紅景天苷(編號(hào):110818,中國(guó)藥品生物制品檢定所);BDNF、兔抗鼠 Nestin一抗,兔抗鼠 NSE一抗(北京搏奧森生物技術(shù)有限公司);Brdu試劑、驢抗鼠 Brdu一抗、兔抗鼠GAD65一抗(武漢搏士德生物工程有限公司);EGF、bFGF(U? S? A)等;胎牛血清 (國(guó)產(chǎn));倒置熒光顯微鏡(重慶蔡康公司),TC2323型二氧化碳培養(yǎng)箱(美國(guó) Sheldon公司 ),單臂腦立體定向儀(M P8000)深圳市瑞沃德公司,微量進(jìn)樣器(10ul)上海激光醫(yī)學(xué)儀器廠等。

1.3 神經(jīng)干細(xì)胞的培養(yǎng)及鑒定

利用無(wú)血清培養(yǎng)技術(shù),在體外進(jìn)行培養(yǎng)及傳代后,進(jìn)行神經(jīng)干細(xì)胞 Nestin免疫熒光鑒定 Nestin鑒定成功后,將傳 3代的神經(jīng)干細(xì)胞接種于六孔培養(yǎng)板中,分 4組,每組 6孔。各組細(xì)胞分別用含血清、BDN F、紅景天苷、BDNF和紅景天苷培養(yǎng)液培養(yǎng),各自培養(yǎng) 3d、7d、 14d,然后進(jìn)行 Brdu、NSE、GAD65免疫熒光鑒定(Brdu用 FITC免疫熒光法顯色為綠色,N SE、GAD65用 Cy3免疫熒光法顯色為紅色),方法同Nestin鑒定。

1.4 分化率的計(jì)算

同一視野下分別對(duì) Brdu/NSE、Brdu/GAD65陽(yáng)性細(xì)胞和明視野下的總細(xì)胞計(jì)數(shù)、分化率為 Brdu/N SE、Brdu/GAD65陽(yáng)性細(xì)胞數(shù) /明視野下的總細(xì)胞數(shù),同一張片子選取四個(gè)不同視野,取平均值。

1.5 癲癇大鼠模型成功的判定

發(fā)作分級(jí)參照 Racine分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)[1]達(dá)標(biāo)準(zhǔn)后均停止給藥。Racine分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)為:0級(jí)無(wú)驚厥,1級(jí)面部痙攣,二級(jí)面部痙攣+節(jié)律性點(diǎn)頭,3級(jí)面部痙攣節(jié)律性點(diǎn)頭前肢陣攣,4級(jí)面部痙攣+節(jié)律性點(diǎn)頭前肢陣攣后肢站立,5級(jí)面部痙攣節(jié)律性點(diǎn)頭前肢陣攣后肢站立跌倒,達(dá)到三級(jí)為入選標(biāo)準(zhǔn)。

1.6 神經(jīng)干細(xì)胞移植

移植時(shí)間為大鼠癲癇模型制作后 4～ 5d,方法為用微量注射器行大鼠左側(cè)大腦海馬 CA3區(qū)注射移植,參照包新民[2]著《大鼠腦立體定位圖譜》,將微量注射器針頭定位于靶點(diǎn)上方,緩慢進(jìn)針,到靶點(diǎn)后,每次計(jì)量為 5μL,注入時(shí)應(yīng)緩慢注入(＞ 5min),含細(xì)胞量為 5×106個(gè) /μL,模型組不予移植。術(shù)后實(shí)驗(yàn)動(dòng)物在動(dòng)物房?jī)?nèi)正常飼養(yǎng),所有大鼠在神經(jīng)干細(xì)胞移植手術(shù)后均不用免疫抑制劑。

1.7 移植前后癲癇大鼠的行為學(xué)觀察

所有癲癇大鼠在制作模型后 ,先采用 Racine分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)法進(jìn)行癲癇的發(fā)作次數(shù)和級(jí)別的觀察。在大鼠進(jìn)行神經(jīng)干細(xì)胞移植治療后,(即移植后 1w、2w、3w、4w)兩次采用 Racine分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)法對(duì)大鼠進(jìn)行癲癇發(fā)作的觀察,具體方法同上。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

計(jì)數(shù)資料用i2檢驗(yàn),計(jì)量資料(±s)多組間比較用方差分析,兩兩比較用q檢驗(yàn),所有數(shù)據(jù)用 spss11.0統(tǒng)計(jì)分析軟件處理及 Excel2003軟件處理,P＜0.05差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 Brdu/NSE陽(yáng)性分化率比較

組內(nèi)比較:BDN F組、紅景天苷組 Brdu/NSE陽(yáng)性分化率 7d與 3,14d相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P＜0.05),BDNF和紅景天苷組 Brdu/NSE陽(yáng)性細(xì)胞分化率 7、14d與 3d相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P＜0.05)。但 7d和 14d比無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;組間比較:紅景天苷組、BDNF和紅景天苷組在 7、14d與對(duì)照組、BDN F組比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P＜0.05),其中BDNF和紅景天苷組 14d的分化率明顯高于紅景天苷組,具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P＜ 0.05)。見(jiàn)表 1。

2.2 Brdu/GAD65陽(yáng)性分化率

組內(nèi)比較:BDNF組 7d與 3d比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)比較(P＜0.05),BDN F和紅景天苷組 7、14d與 3d相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P＜0.05),而 14d與 7d比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05);組間比較:7dBDNF組、BDN F和紅景天苷組與其他兩組相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P＜0.05),而前兩者之間比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,BDNF和紅景天苷組 14d與其他三組相對(duì)應(yīng)時(shí)間點(diǎn)比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜ 0.05)。見(jiàn)表 2。

2.3 移植后大鼠癲癇發(fā)作次數(shù)比較

N SCs+BDNF+紅景天苷組分化率最高為篩選組,給予進(jìn)行癲癇大鼠移植。癲癇發(fā)作次數(shù)的比較見(jiàn)表 3,發(fā)作次數(shù)以一周內(nèi)單位動(dòng)物癲癇發(fā)作次數(shù)的均數(shù)計(jì)算,前兩周各組癲癇大鼠發(fā)作次數(shù)都有所減少,但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)意義。在第三周時(shí),NSCs+BDN F+紅景天苷組移植組大鼠癲癇發(fā)作次數(shù)較模型組和 NSCs移植組明顯減少,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05),在第四周,NSCs+BDNF+紅景天苷移植組大鼠癲癇發(fā)作次數(shù)較其他的組明顯減少,有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05),說(shuō)明 N SCs+BDNF+紅景天苷共移植后能降低大鼠癲癇發(fā)作次數(shù)。

表 1 各組不同時(shí)間點(diǎn)的 Brdu/NSE陽(yáng)性分化率(%,±s,n=6)

表 1 各組不同時(shí)間點(diǎn)的 Brdu/NSE陽(yáng)性分化率(%,±s,n=6)

注:#組內(nèi)比較 P ＜0.05?！?組間比較 P ＜ 0.05。△△:與紅景天苷組 14d時(shí)比較 P ＜ 0.05。

時(shí)間(d) 對(duì)照組 BDNF組 紅景天苷組 BDNF和紅景天苷組3 11.506± 0.35 11.502± 0.60 11.160± 0.462 11.128± 0.501 7 12.386± 1.795 12.577± 0.851# 14.796± 1.466# △ 15.586± 1.410# △14 12.169± 0.715 12.276± 0.960 13.627± 1.186△ 15.912± 1.546# △△

表 2 各組不同時(shí)間點(diǎn)的 Brdu/GAD65陽(yáng)性分化率(%,±s,n=6)

表 2 各組不同時(shí)間點(diǎn)的 Brdu/GAD65陽(yáng)性分化率(%,±s,n=6)

注:#組內(nèi)比較 P ＜ 0.05。## :與 BDN F組 3d時(shí)比較 P ＜ 0.05。##:與 BDN F和紅景天苷組 7d時(shí)比較 P ＜ 0.05?！?:組間 P ＜ 0.05。

對(duì)照組 BDNF組 紅景天苷組 BDNF和紅景天苷組時(shí)間(d)10.119± 0.812 10.621± 0.300 10.392± 0.395 10.588± 0.289 7 10.318± 0.821 11.201± 0.311## △ 10.629±0.536 11.859± 0.624# △14 10.622± 0.435 10.790± 0.281 11.081± 0.371 12.758± 0.708## △3

表 3 移植后大鼠癲癇發(fā)作次數(shù)比較(±s,n=6)

表 3 移植后大鼠癲癇發(fā)作次數(shù)比較(±s,n=6)

注:*與模型組相比較 P＜0.05?！襞c N SCs移植組比較 P＜0.05?！c NSCs+BDN F+紅景天苷組 3w比較 P＜0.05。

組別1w 2w 3w 4w模型組 4.33± 1.03 3.67± 1.03 3.33± 0.52 2.83± 0.75 N SCs組 4.17± 0.175 3.67± 0.82 3.12± 0.75 2.17± 0.75 N SCs+ BDNF+紅景天苷組 4.00±0.89 3.50±0.84 2.33±0.82*◆ 0.83±0.91*◆▲

3 討論

在體內(nèi)及體外大量研究表明,神經(jīng)干細(xì)胞具有多分化功能,但神經(jīng)干細(xì)胞的定向分化研究才剛剛起步,GABA是中樞神經(jīng)系統(tǒng)中重要的抑制性氨基酸,神經(jīng)干細(xì)胞治療癲癇的最主要的一個(gè)機(jī)理就是增加抑制性神經(jīng)元(GABA神經(jīng)元)的數(shù)量,以此來(lái)恢復(fù)谷氨酸與 r-氨基丁酸之間的平衡,從而減少癲癇的發(fā)生。谷氨酸脫羧酶(GAB65)是 GABA能神經(jīng)元的生物合成限速酶,主要存在于該神經(jīng)元的軸突末梢內(nèi)[3],有研究發(fā)現(xiàn),GABA能神經(jīng)數(shù)目變少,則胞內(nèi) r-氨基丁酸的釋放量也降低,GAD活性也受到抑制,所以本實(shí)驗(yàn)用GAD65作為 GABA能神經(jīng)元的標(biāo)記物,進(jìn)行 GABA能神經(jīng)元鑒定。

BDNF屬于神經(jīng)生長(zhǎng)因子家族或神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)素家族中的一員。BDNF不僅是在維持神經(jīng)元正常的生理功能起著關(guān)鍵作用,而且在中樞神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育過(guò)程中對(duì)神經(jīng)元的生存、分化、生長(zhǎng)也起著極為重要的作用。 Viario-AbeJ ó n等[4]研究表明 ,BDNF可使 E16海馬區(qū) bFGF反應(yīng)性神經(jīng)干細(xì)胞分化為 GABA能神經(jīng)元的比例增高。另外謝青松[5]等人的實(shí)驗(yàn)可以得知,BDNF還有促進(jìn) bHLH基因表達(dá)作用,有利于神經(jīng)干細(xì)胞的定向分化。也有人研究發(fā)現(xiàn),一些中藥成分也具有促進(jìn)神經(jīng)干細(xì)胞分化為神經(jīng)元的作用。其中主要有紅景天苷,紅景天苷是中藥紅景天的主要有效成分,張維燁[6]等通過(guò)研究紅景天苷對(duì)神經(jīng)干細(xì)胞作用的研究證實(shí),紅景天苷在體外可以促進(jìn)神經(jīng)干細(xì)胞向神經(jīng)元分化。研究也發(fā)現(xiàn),紅景天及其提取物在很多方面對(duì)神經(jīng)系統(tǒng)都有著作用,紅景天苷可以通過(guò)抑制細(xì)胞的鈣離子超載,降低神經(jīng)細(xì)胞凋亡[7]。另外紅景天苷可以通過(guò)增加大鼠嗅球當(dāng)中的 bFGF以及海馬中神經(jīng)生長(zhǎng)因子的數(shù)量,進(jìn)而提高大鼠的學(xué)習(xí)以及記憶能力[8,9]。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示,在體外,BDNF與紅景天苷聯(lián)合有利于神經(jīng)干細(xì)胞向神經(jīng)元方向分化,此外二者聯(lián)合有利于GABA能神經(jīng)元分化;同時(shí)二者聯(lián)合移植致癲鼠后能減少大鼠癲癇發(fā)作的次數(shù)。其機(jī)制可能是因?yàn)榧t景天苷通過(guò)抑制細(xì)胞內(nèi)鈣離子超載而降低神經(jīng)細(xì)胞凋亡[7],從而減少海馬區(qū)受損神經(jīng)元的死亡。有研究也發(fā)現(xiàn) BDN F能顯著抑制驚厥發(fā)作后的神經(jīng)元壞死和凋亡[10]?？赡苁窃趦烧叩墓餐饔孟?使癲癇發(fā)作后的神經(jīng)元死亡數(shù)量大大減少。另外紅景天苷能增加 bFGF海馬中神經(jīng)生長(zhǎng)因子的數(shù)量,而 bFGF通過(guò)提高NSCs分裂,而增加移植到體內(nèi)的神經(jīng)干細(xì)胞的數(shù)量,并促使NSCs向神經(jīng)元方向分化。同樣 ,大量研究顯示 BDN F可誘導(dǎo)神經(jīng)干細(xì)胞向神經(jīng)元尤其是 GABA能神經(jīng)元分化并促進(jìn)其成熟。兩者聯(lián)合神經(jīng)干細(xì)胞移植后,可能是在體內(nèi)紅景天苷大大增加了 BDNF的數(shù)量,從而使 GABA能神經(jīng)元明顯增多,從而對(duì)癲癇發(fā)作產(chǎn)生的抑制作用,但是具體機(jī)制仍有待進(jìn)一步研究,隨著神經(jīng)干細(xì)胞移植治療神經(jīng)系統(tǒng)疾病的不斷進(jìn)展,在癲癇治療上一定會(huì)取得更好的結(jié)果。

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