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(1.吉林大學(xué)再生醫(yī)學(xué)科學(xué)研究所，吉林 長(zhǎng)春 130021；2.長(zhǎng)春中醫(yī)藥大學(xué)，吉林 長(zhǎng)春 130117；3.吉林省腫瘤醫(yī)院，吉林 長(zhǎng)春 130012；4.吉林省中醫(yī)藥科學(xué)院，吉林 長(zhǎng)春 130021；5.吉林大學(xué)第一醫(yī)院，吉林 長(zhǎng)春 130021)

委陵菜(Potentillachinesis)為薔薇科委陵菜屬植物，具有清熱解毒，涼血止痢之功能[1]。由于療效確切，在《中國(guó)藥典》歷版中均被收載[2]。該屬植物較多，僅吉林省境內(nèi)就有10種之多。由于它們的親緣關(guān)系接近，在同一生境內(nèi)或不同生境內(nèi)生長(zhǎng)的各個(gè)物種間從外觀上很難區(qū)別，加之所含化學(xué)成分接近，因而，用傳統(tǒng)的外觀鑒別，顯微鑒別，薄層色譜鑒別很難達(dá)到滿(mǎn)意效果[3],導(dǎo)致誤采，誤用，影響療效。為此,我們采用ITS序列分析，對(duì)我省地產(chǎn)委陵菜屬植物進(jìn)行鑒別，以彌補(bǔ)上述方法的不足。

1 材料與方法

1.1 材料 委陵菜，伏委陵菜，小叉葉委陵菜，霉葉委陵菜，蔓委陵菜為硅膠快速干燥的葉片。分別采集于長(zhǎng)吉高速公路和長(zhǎng)春南湖公園處。均由長(zhǎng)春中醫(yī)藥大學(xué)鄧明魯教授鑒定(見(jiàn)表1)。

1.2 DNA提取 稱(chēng)取0.3 g各樣品葉片，置于培養(yǎng)皿中，加水少許，浸泡至充分展開(kāi)，剪去病斑，用棉球擦拭葉片，去除雜質(zhì)，再用70%乙醇擦拭葉片表面，然后用超純水清洗3次，置于超凈臺(tái)上干燥;在液氮中研磨成細(xì)粉，然后按說(shuō)明用北京鼎國(guó)植物基因組DNA提取試劑盒提取其總DNA，溶于適量的超純水中。取5 μL用1%瓊脂糖凝膠電泳，檢查DNA質(zhì)量和數(shù)量。

1.3 引物設(shè)計(jì) 選擇被子植物ITS通用引物[4],由寶生物(中國(guó)大連)合成，其序列如下：

PCR引物：ITS-F:5→-TCC ACT GAA CCT TAT CAT TTA G-3→ ITS-R:5→-CCA TGC TTA AAC TCA GCG GGT-3→

測(cè)序用引物I:TS-1F:5→-TCC ACT GAA CCT TAT CAT TTA G-3→ In-18S-25S-3→R:5→-GAC TCG ATG GTT CAC GGG ATT CT-3→ In-18S-25S-5→F:5→-TCT CGC ATC GAT GAA GAA CG-3→ 18S-25S-3→R:5→-CCA TGC TTA AAC TCA GCG GGT-3→

1.4 DNA擴(kuò)增 擴(kuò)增采用50 μL體系，其中1.3引物各1 μL，模板各5 μL，10×Buffer 5 μL，dNTPs 5 μL，Taq DNA多聚酶1 μL，超純凈水32 μL。反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性5 min。94 ℃ 1 min，55 ℃ 2 min，72 ℃2 min,循環(huán)35次。72 ℃延長(zhǎng)循環(huán)10 min，4 ℃保存。

1.5 測(cè)序 1.4 PCR產(chǎn)物經(jīng)Montage PCR Filter Units (Millipore Corporation，U.S.A.)純化后，進(jìn)行測(cè)序反應(yīng)。反應(yīng)采用10 μL體系，用ABI BigDye Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit(Applied Biosystems，U.S.A.)測(cè)序,其中含5×sequencing buffer 2.0 μL BigDye(3.1)0.5 μL,純化模板1.0 μL，1.3引物1.0 μL，純凈水5.5 μL。反應(yīng)條件：預(yù)變性96 ℃ 1 min。96 ℃ 30 s，50 ℃ 5 s,循環(huán)25次。60 ℃延長(zhǎng)4 min。

1.6 序列分析 采用網(wǎng)頁(yè)http://bioinfo.genopole-toulouse.prd.fr/multalin/multalin.html和Genetyx-SV/RC version 11.0 (Software Development Co.，Ltd.，Tokyo，Japan) 進(jìn)行序列的比對(duì)和編輯。

2 結(jié)果

2.1 采集委陵菜的相關(guān)信息 見(jiàn)表1。

2.2 5種委陵菜ITS序列比較 見(jiàn)圖1。

表1 樣品的采集地點(diǎn)和時(shí)間

圖1 5種委陵菜ITS序列比較

3 結(jié)論

如圖1所示，委陵菜各種間ITS序列差異明顯，故ITS序列分析及其衍生的方法可以用于鑒別委陵菜。 本研究所采取委陵菜樣本本身ITS序列也存在有一定的差異，序列分析顯示可能是由于雜交所致。

委陵菜種類(lèi)繁多，僅吉林省內(nèi)就有10余種之多，所以本研究?jī)H僅是一個(gè)開(kāi)始，在今后的研究中需要擴(kuò)大研究樣本的種類(lèi)，蓄積更多的資料，只有這樣才能更準(zhǔn)確地對(duì)委陵菜各種間進(jìn)行鑒別。

[1]趙川,喬衛(wèi),張彥文,等.委陵菜抗糖尿病有效部位及有效成分的研究[J].中國(guó)中藥雜志.2008(33):680-682.

[2]中華人民共和國(guó)藥典委員會(huì).中國(guó)藥典[M].北京:化學(xué)工業(yè)出版社,2010:199.

[3]楊婷,孫海峰,曹思思,等.10種委陵菜生藥學(xué)研究[J].時(shí)珍國(guó)醫(yī)國(guó)藥.2008(19):3039-3041.

[4]Takaiwa F,Oono K,Sugiura M.Nucleotide sequence of the 17S-25S spacer region from rice rDNA[J].Plant Molecular Biology,1985(4):355-364.