毛 萍，蔣 彬，馬欣榮，鄧霄禹，喬定君，楊 宏

(1.中國科學(xué)院成都生物研究所生態(tài)恢復(fù)重點實驗室，四川 成都 610041； 2.中國科學(xué)院研究生院，北京 100049； 3.成都大學(xué)生物產(chǎn)業(yè)學(xué)院，四川 成都 610106)

隨著生物技術(shù)的發(fā)展，轉(zhuǎn)基因技術(shù)已成為牧草和作物遺傳改良的有效途徑[1]；而隨著轉(zhuǎn)基因技術(shù)的發(fā)展、轉(zhuǎn)基因作物種植面積的擴大和轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品商品化程度的加深，“轉(zhuǎn)基因”以及其衍生物的生物安全性引起了政界、商界、產(chǎn)業(yè)界、學(xué)術(shù)界和民眾的廣泛關(guān)注和深入討論。其中，轉(zhuǎn)基因植物投放大田中，因選擇標記基因的存在而產(chǎn)生的安全性問題是爭論中的焦點[2-3]。目前，已經(jīng)有超過50種標記基因用于科研和商業(yè)，而傳統(tǒng)的選擇標記基因，如抗生素和除草劑等抗性篩選基因[4]，在很多國家和地區(qū)受到質(zhì)疑，認為它們的存在會對人類健康、食品安全和生態(tài)環(huán)境帶來威脅。因此，選擇合適的、安全的、有效的標記基因，是擺在轉(zhuǎn)基因科研人員眼下的難題，也是必須要解決的技術(shù)問題之一[5-6]。糖類代謝酶標記基因顯示出了巨大的應(yīng)用潛力。它們的編碼產(chǎn)物是某種糖類的分解代謝酶，轉(zhuǎn)化細胞能利用選擇劑糖類作為主要碳源，可在選擇培養(yǎng)基上生長擴增，而非轉(zhuǎn)化細胞因不能利用選擇劑糖類，處于饑餓狀態(tài)，生長受到抑制但不被殺死，被稱為正選擇系統(tǒng)(positive selection system)[7]。由于非轉(zhuǎn)化細胞不被殺死，從而避免了死亡細胞所釋放的有毒代謝物對轉(zhuǎn)化細胞的不利影響，并且選擇劑無毒副作用也有利于轉(zhuǎn)化細胞的再生,所以一般正選擇系統(tǒng)都可以取得較高的轉(zhuǎn)化率[8]。

木糖異構(gòu)酶(xylose isomerase，xylA)基因編碼木糖異構(gòu)酶，大部分植物細胞不能以木糖作為碳源，但能以D-木酮糖作為主要碳源。木糖異構(gòu)酶能催化D-木糖轉(zhuǎn)化為D-木酮糖， 然后再經(jīng)過磷酸戊糖途徑分解代謝，為細胞生長所利用。在以D-木糖為篩選劑的培養(yǎng)基上， 轉(zhuǎn)化細胞能將D-木糖轉(zhuǎn)化為D-木酮糖而獲得優(yōu)勢生長，非轉(zhuǎn)化細胞因缺乏碳源而被抑制生長。早在1998年，Haldrup等[9]用D-木糖為唯一碳源的培養(yǎng)基篩選轉(zhuǎn)化的馬鈴薯(Solanumtuberosum)、煙草(Nicotianatabacum)和西紅柿(Lycopersiconesculentum)等植物細胞，成功地獲得了轉(zhuǎn)基因植株，且在馬鈴薯和西紅柿的轉(zhuǎn)化中，獲得了比用npt II基因作為篩選標記基因時高幾倍的轉(zhuǎn)化效率。郭新梅等[10]也認為，以木糖作為篩選劑， 可以減小潛在的生物安全隱患。該研究小組利用木糖異構(gòu)酶基因作為篩選標記，在含有不同濃度木糖的培養(yǎng)基上篩選出玉米(Zeamays)再生植株。韋正乙[11]從大腸桿菌(Escherichiacoli)基因組中克隆了木糖異構(gòu)酶基因xylA，遂利用xylA為篩選標記，建立了百脈根(Lotuscorniculatus)轉(zhuǎn)基因技術(shù)體系，其轉(zhuǎn)化效率為45.5%，與除草劑篩選轉(zhuǎn)化體系的效率(46.7%)相當(dāng)，但轉(zhuǎn)化周期提前10 d以上。趙輝等[12]在對香蕉(Musanana)進行甘露糖和木糖敏感性研究過程中發(fā)現(xiàn)，香蕉對D-木糖特別敏感，D-木糖可以作為香蕉有效的正篩選劑。天然D-木糖以多糖的形態(tài)存在于植物中，有的細菌能利用D-木糖為碳源進行發(fā)酵，動物能夠完全或部分地利用木糖，木糖異構(gòu)酶已在食品工業(yè)中達到了商品化的程度，所以在植株轉(zhuǎn)化中利用xylA基因作為選擇標記是十分安全的[13]。

多年生黑麥草(Loliumperenne)原產(chǎn)于亞洲和北非的溫帶地區(qū)，因具有抗寒、耐踐踏、再生能力強、成坪快等優(yōu)點而被廣泛應(yīng)用于世界各地的溫帶地區(qū)[14]。由于不同植物對木糖具不同的敏感性，目前多年生黑麥草轉(zhuǎn)基因的木糖篩選體系在國內(nèi)外沒有任何報道。并且有關(guān)木糖對植物生長影響的研究，亦鮮有報道。為了在多年生黑麥草遺傳轉(zhuǎn)化中有效地利用木糖篩選系統(tǒng)，本研究以多年生黑麥草成熟種子誘導(dǎo)出的愈傷組織為外植體，研究以木糖為碳源對其愈傷組織培養(yǎng)的影響，有望為利用木糖異構(gòu)酶基因作為篩選標記基因的多年生黑麥草遺傳轉(zhuǎn)化提供依據(jù)，為進一步建立穩(wěn)定、有效、安全的篩選體系打下基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1材料 多年生黑麥草種子，品種“匹克”，購自百綠國際草業(yè)有限公司。

無機鹽，有機鹽，維生素類，氨基酸，蔗糖，麥芽糖，木糖購自成都科龍試劑公司；瓊脂粉為日本進口分裝；植物凝膠(phytagel，gelrite)，購自SIGMA公司；6-芐氨基嘌呤(BA)、二氯苯氧乙酸(2,4-D)、吲哚乙酸(IAA)、萘乙酸(NAA)均由荷蘭Duchefa公司生產(chǎn)；其他化學(xué)試劑均為進口分裝或國產(chǎn)分析純產(chǎn)品。

1.2愈傷組織誘導(dǎo)、培養(yǎng)和處理 愈傷組織誘導(dǎo)和繼代的基本培養(yǎng)基是MS培養(yǎng)基[15]。愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基(callus induction medium,IM)組分為MS+7 mg/L 2,4-D (2,4-二氯苯氧乙酸)+2.4 g/L植物凝膠+30 g/L麥芽糖；愈傷組織繼代培養(yǎng)基(callus sub-cultivation medium,SM)組分為MS+3 mg/L 2,4-D+2.4 g/L植物凝膠+糖(不同質(zhì)量濃度蔗糖、木糖或蔗糖+木糖)，pH值5.8。在24～26℃下暗培養(yǎng)。蔗糖、木糖和蔗糖+木糖質(zhì)量濃度及相應(yīng)的培養(yǎng)基編號見表1。

表1 不同糖質(zhì)量濃度處理

選取外觀均一、飽滿的成熟種子，70%乙醇處理2 min后，加入含活性氯3%～4%的次氯酸鈉水溶液(加入少量Triton X-100)滅菌15～20 min，再用無菌水清洗5～6次。超凈臺剝?nèi)∨呓臃N到愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基(IM)上，誘導(dǎo)培養(yǎng)3周。選取生長狀態(tài)良好、顏色淡黃、大小一致的愈傷組織，轉(zhuǎn)接到含30 g/L麥芽糖的繼代培養(yǎng)基中培養(yǎng)4周。選取生長良好的愈傷組織，剝離成直徑約4 mm大小，分別轉(zhuǎn)接到含不同糖濃度的繼代培養(yǎng)基(SM)中，于24～26℃黑暗條件下培養(yǎng)5周[15]。愈傷組織數(shù)為30個/皿，每處理5皿，共150個愈傷組織。觀察愈傷組織的生長情況，并統(tǒng)計接入前后愈傷組織的質(zhì)量變化情況。

1.3統(tǒng)計分析 采用SPSS V 16.0統(tǒng)計分析軟件，進行DUNCAN 測驗(P<0.05)。

2 結(jié)果與分析

2.1相同濃度的蔗糖和木糖對愈傷組織生長的影響 分別以蔗糖5 g/L(編號S1)、10 g/L(S2)、20 g/L(S3)、30 g/L(S4)和木糖5 g/L(編號X1)、10 g/L(X2)、20 g/L(X3)、30 g/L(X4)以及蔗糖+木糖混合糖作為SM培養(yǎng)基中的碳源，添加到培養(yǎng)基中(表1)，培養(yǎng)5周后觀察并統(tǒng)計生長量，結(jié)果見圖1、2。

圖1 含蔗糖或木糖的培養(yǎng)基中愈傷組織的生長情況

圖2 蔗糖與木糖不同配比下愈傷組織的生長狀態(tài)

比較蔗糖和木糖對多年生黑麥草愈傷組織生長的影響，結(jié)果顯示，在添加單糖(0～30 g/L)的繼代培養(yǎng)基中，隨著糖質(zhì)量濃度的增加，愈傷組織生長量呈上升趨勢，添加蔗糖的培養(yǎng)基中愈傷組織的生長狀況顯著(P<0.05)優(yōu)于添加木糖的培養(yǎng)基的(圖1)。添加蔗糖的S1、S2、S3、S4愈傷組織平均生長量(mg/個)分別比添加木糖的X1、X2、X3、X4增加2.190、7.377、35.956、68.370 mg。方差分析表明，質(zhì)量濃度為20和30 g/L時差異極顯著(P<0.01)(圖1)。

在添加蔗糖的培養(yǎng)條件下， 0、5、10、20和30 g/L質(zhì)量濃度之間愈傷組織生長量差異顯著(P<0.05)。在添加木糖的培養(yǎng)條件下，20和30 g/L質(zhì)量濃度之間愈傷組織生長量差異不顯著(P>0.05)，其他質(zhì)量濃度間差異顯著(P<0.05)。

上述結(jié)果表明，黑麥草愈傷組織在同等條件下，分解和利用木糖的能力要遠低于利用蔗糖作為碳源的能力，顯示多年生黑麥草不能有效利用木糖作為碳源。但是與對照相比，生長量均高于對照。并且對照組在基本MS培養(yǎng)基中，亦有一定程度地生長。

2.2蔗糖/木糖不同比例對愈傷組織生長的影響 以總糖含量為30 g/L作為培養(yǎng)基中添加糖分的質(zhì)量濃度，分析蔗糖+木糖不同比例對愈傷組織生長的影響，結(jié)果見圖2。隨著木糖質(zhì)量濃度增加、蔗糖降低，愈傷組織生長量下降。S4(30 g/L蔗糖)培養(yǎng)條件下愈傷組織生長量最大；M1(25 g/L蔗糖+5 g/L木糖)、M2(20 g/L蔗糖+10 g/L木糖)、M3(15 g/L蔗糖+15 g/L木糖)生長量較S4低，但明顯高于M4(10 g/L蔗糖+20 g/L木糖)、M5(5 g/L蔗糖+25 g/L木糖)和X4(30 g/L木糖)。S4與M1、M2和M3相比，差異顯著(P<0.05)；而M1、M2和M3較之M4、M5和X4，差異也顯著(P<0.05)。

M5和X4培養(yǎng)條件下愈傷組織生長量為最小，平均生物量積累分別為73.50和70.66 mg/個，且二者之間差異不顯著(P>0.05)。

上述研究結(jié)果表明，木糖能顯著限制多年生黑麥草愈傷組織生長。因此，在維持細胞正常的滲透壓下，可以在培養(yǎng)基中加入5 g/L蔗糖+25 g/L木糖或者30 g/L木糖作為木糖篩選體系中的篩選壓。

3 討論與結(jié)論

大部分植物細胞不能以木糖作為碳源，但能以D-木酮糖作為主要碳源。木糖經(jīng)過木糖異構(gòu)酶催化，能將D-木糖轉(zhuǎn)化為D-木酮糖，然后再經(jīng)過磷酸戊糖途徑分解代謝，為細胞生長所利用。大部分植物不含木糖異構(gòu)酶基因。黑麥草是否能利用木糖作為碳源，迄今未見報道。本研究表明，木糖對黑麥草愈傷組織生長有顯著影響。愈傷組織生長量隨糖濃度增加呈增加趨勢，且在含蔗糖培養(yǎng)基中愈傷組織的生長顯著優(yōu)于含木糖的培養(yǎng)基。在混合培養(yǎng)中(糖總量30 g/L)，隨著蔗糖含量減少、木糖含量增加，愈傷組織生長量下降，表明木糖能顯著抑制多年生黑麥草愈傷組織的生長。推測多年生黑麥草愈傷組織不能有效分解D-木糖為自己所用而導(dǎo)致缺乏碳源，生長受到較大程度地限制。

然而，在含木糖培養(yǎng)基中愈傷組織能有一定程度的生長，并且生長明顯高于對照。通常在組織培養(yǎng)中，加30～40 g/L的蔗糖或麥芽糖或葡萄糖等，不僅為植物生長提供碳源，同時對維持植物細胞正常的滲透壓起著重要作用。因此，推測可能是一定濃度的糖，對于維持細胞的滲透壓起著重要作用，因此生長優(yōu)于對照，并且以30 g/L生長最好。

觀察發(fā)現(xiàn)，對照亦有一定地生長。由于MS基本培養(yǎng)基中含有植物生長所需要的大量元素、微量元素、鐵鹽、維生素等，能維持愈傷組織的基本生長，因此沒有加糖的對照，亦能保持活性并緩慢生長。

在總糖量為30 g/L時， MS+5 g/L蔗糖+25 g/L木糖和只含有30 g/L木糖的培養(yǎng)基中，愈傷組織生長量最低。因此，在以多年生黑麥草愈傷組織為外植體的木糖篩選體系中，在維持細胞正常的滲透壓條件下推薦使用5 g/L蔗糖+25 g/L木糖或者只含有30 g/L的木糖作為選擇壓。該結(jié)果與在玉米中的研究結(jié)果相似[10]。由于在木糖培養(yǎng)基中愈傷組織有一定地生長，推測可能在選擇中會產(chǎn)生一定量的假陽性。有關(guān)木糖對愈傷組織分化和植株生長的影響有待進一步研究。

目前，以糖類為正向篩選標記基因的遺傳轉(zhuǎn)化體系已經(jīng)應(yīng)用到多種植物轉(zhuǎn)基因工作中，其中研究較多的為甘露糖陽性選擇系統(tǒng)[17-20]。糖類篩選系統(tǒng)優(yōu)于抗生素和除草劑等負向篩選系統(tǒng)，因其不產(chǎn)生細胞毒性，也不會產(chǎn)生由于選擇劑的使用而對環(huán)境造成污染和破壞的不良后果，可作為綠色安全的篩選基因。本研究表明，木糖作為安全的選擇標記，具有潛在的應(yīng)用價值。因此，異構(gòu)酶在植物遺傳轉(zhuǎn)化中有良好的應(yīng)用前景。但是，目前利用木糖異構(gòu)酶基因的木糖陽性選擇系統(tǒng)在在植物轉(zhuǎn)基因的運用中，有關(guān)報道較少，相關(guān)研究尚需深入進行。

綜上所述，本研究結(jié)果為進一步建立木糖為選擇劑的黑麥草遺傳轉(zhuǎn)化系統(tǒng)提供了依據(jù)。

[1] 張磊，吳金霞，董芳，等.抗逆轉(zhuǎn)ABP 9基因黑麥草和高羊茅植株的鑒定[J].草業(yè)科學(xué)，2010，27(7)：72-77.

[2] 錢方，高志芳，滕木子，等.轉(zhuǎn)基因作物的安全標記基因[J].河南農(nóng)業(yè)科學(xué)，2007(7):17-20.

[3] 楊英軍，周鵬.轉(zhuǎn)基因植物中的標記基因研究新進展[J].遺傳，2005，27(3):499-504.

[4] 劉立俠，李桂民，路云俠，等.中國牧草生物技術(shù)的研究現(xiàn)狀和展望(英文)[J].草地學(xué)報,2009，17(3)：389-401.

[5] Sundar I K,Sakthivel N.Advances in selectable marker genes for plant transformation[J].Journal of Plant Physiology,2008,165:1698-1716.

[6] Ramessar K,Peremarti A,Gómez-Galera S,etal.Biosafety and risk assessment framework for selectable marker genes in transgenic crop plants:A case of the science not supporting the politics[J].Transgenic Reseach,2007,16:261-280.

[7] Bojsen K,Donaldson I,Haldrup A,etal.Mannose or xylose based positive selection:United States,5767378[P].1998-06-16.

[8] Joersbo M,Okkels F T.A novel principle for selection of transgenic plant cells:Positive selection[J].Plant Cell Reports,1996,16:219-221.

[9] Haldrup A,Petersen S G,Okkels F T.The xylose isomerase gene from Thermoanaerobacterium thermosulfurogenes allows effective selection of transgenic plant cells using D-xylose as the selection agent[J].Plant Molecular Biology， 1998,37(2):287-296.

[10] 郭新梅， 張曉東， 梁榮奇，等.以木糖異構(gòu)酶基因為篩選標記的玉米遺傳轉(zhuǎn)化[J].植物生理與分子生物學(xué)學(xué)報，2007，33(6)：547-552.

[11] 韋正乙.利用安全篩選標記轉(zhuǎn)化系統(tǒng)獲得抗逆轉(zhuǎn)基因百脈根[A].中國遺傳學(xué)會第八次代表大會暨學(xué)術(shù)討論會論文摘要匯編(2004-2008)[C].重慶：中國遺傳學(xué)會第八次代表大會暨學(xué)術(shù)討論會，2008:53-54.

[12] 趙輝，范武波，朱蕓，等.香蕉對甘露糖和木糖的敏感性研究[J].果樹學(xué)報，2010，27(2)：233-237.

[13] Pawan K J,Lingaraj S,Dolendro Singh N,etal.Strategies to deal with the concern about marker genes in transgenic plants:Some environment friendly approaches[J].Current Science,2002,83(2):128-136.

[14] 于玉紅，王亮，黃曉露，等.6個多年生黑麥草品種的交播性狀比較[J].草業(yè)科學(xué)，2009，26(8)：172-176.

[15] Murashige T,Skoog F.A revised medium for rapid growth and bioassays with tobacco cultures[J].Plant Physiology,1962,15:473-497.

[16] 趙小強，馬暉玲，林棟，等.草地早熟禾新格萊德胚性愈傷組織原生質(zhì)體培養(yǎng)及植株再生的研究[J].草業(yè)學(xué)報，2010,19(2)：55-60.

[17] 王彩芬，付永彩.甘露糖陽性選擇系統(tǒng)在水稻遺傳轉(zhuǎn)化中的應(yīng)用研究進展[J].中國稻米，2008(4)：22-24.

[18] 彭世清，陳守才.甘露糖陽性選擇系統(tǒng)的建立及在番茄轉(zhuǎn)化中的應(yīng)用[J].農(nóng)業(yè)生物技術(shù)學(xué)報,2005,13(2):141-144.

[19] 姚明鏡，李和平，廖玉才.甘露糖對小麥不同外植體愈傷誘導(dǎo)及生長的影響[J].麥類作物學(xué)報，2007,27(1)：7-11.

[20] 吳楊，傅華英，趙書環(huán)，等.甘露糖對甘蔗外植體再生的影響[J].福建農(nóng)林大學(xué)學(xué)報，2008，37(3)：225-229.