趙麗君，王雪芳，張金林，王鎖民

(蘭州大學(xué)草地農(nóng)業(yè)科技學(xué)院，甘肅 蘭州 730020)

植物組織培養(yǎng)(plant tissue culture)起源于20世紀(jì)初，從20世紀(jì)至今經(jīng)歷了3個階段：萌芽階段(20世紀(jì)初-20年代末)、奠定階段(30年代初-50年代中)和蓬勃發(fā)展階段(50年代末至今)。1902年，德國植物學(xué)家Haberlandt[1]提出“植物細(xì)胞具有全能性”的理論，并將從虎眼萬年青屬(Ornithogalum)植物表皮細(xì)胞及Lamiumpurpureum和鳳眼蓮(Eichhorniacrassipes)葉肉柵欄組織中分離出的單個細(xì)胞置于含有蔗糖的Knop溶液中培養(yǎng)，這是植物組織培養(yǎng)的開端；20世紀(jì)30年代，White等[2]培養(yǎng)離體番茄(Lycopersiconesculentum)根尖，建立了可以繼代培養(yǎng)的第一個無性繁殖系，確立了植物組織培養(yǎng)的基本方法，40年代開始將植物激素應(yīng)用于植物組織培養(yǎng)中，使得植物組織培養(yǎng)得到了長足的發(fā)展[3]；英國學(xué)者Steward和Mapes[4]將胡蘿卜(Daucuscarota)髓細(xì)胞培養(yǎng)成一個完整的植株，這是植物組織培養(yǎng)的第一個突破，60年代開始，植物組織培養(yǎng)迅速發(fā)展，并開始應(yīng)用于生產(chǎn)實際中。目前，植物組織培養(yǎng)技術(shù)已滲透到植物生理學(xué)、病理學(xué)、遺傳學(xué)、育種學(xué)、藥學(xué)以及生物化學(xué)等研究領(lǐng)域，成為生物學(xué)科中的重要研究技術(shù)和手段之一，推動了相關(guān)學(xué)科的迅速發(fā)展。特別是植物組織培養(yǎng)技術(shù)與分子生物學(xué)及RNA干擾(RNA interference,RNAi)技術(shù)緊密結(jié)合，成為細(xì)胞生物學(xué)和細(xì)胞遺傳學(xué)研究的基礎(chǔ)。植物組織培養(yǎng)技術(shù)還被廣泛應(yīng)用于農(nóng)業(yè)、林業(yè)、工業(yè)、醫(yī)藥業(yè)等多種行業(yè)，從而在生產(chǎn)實踐方面產(chǎn)生了巨大的經(jīng)濟(jì)效益和社會效益。植物組織培養(yǎng)技術(shù)在草類植物中的研究和應(yīng)用雖然起步較晚，但近年來發(fā)展非常迅速，已被廣泛應(yīng)用于草類植物優(yōu)良營養(yǎng)系的快速繁育[5-11]、遺傳轉(zhuǎn)化[12-27]、細(xì)胞和分子育種[28-31]以及次生代謝產(chǎn)物生產(chǎn)[32-34]等諸多方面。本研究對影響植物組織培養(yǎng)的因素、存在的主要問題及其解決方法進(jìn)行探討，并重點闡述組織培養(yǎng)在草類植物中的研究和應(yīng)用。

1 影響植物組織培養(yǎng)的因素

影響植物組織培養(yǎng)的內(nèi)外因素很多，歸納起來主要有：外植體基因型、外植體的種類、培養(yǎng)基、植物生長調(diào)節(jié)劑的種類及濃度配比以及培養(yǎng)條件等。

1.1外植體基因型 外植體是指植物組織培養(yǎng)中作為離體培養(yǎng)材料的器官或者組織的片段，外植體材料的遺傳背景對植物組織培養(yǎng)的影響很大，不同植物或相同植物不同品種間存在著顯著的差異，基因型細(xì)微的差異都會造成材料的內(nèi)源激素含量不同，引起不同品種間相同外植體的分化頻率和分化速度間差異的產(chǎn)生[35]。外植體的基因型影響植物的再生能力，劉建平等[36]就冬小麥(Triticumaestivum)不同基因型對花藥愈傷組織誘導(dǎo)率作了相關(guān)研究，發(fā)現(xiàn)不同基因型在同一培養(yǎng)環(huán)境條件下愈傷組織誘導(dǎo)率有明顯差異。何道一等[37]也比較了不同基因型蘋果(Maluspumila)的離體再生特點，結(jié)果表明,不同基因型蘋果葉片再生頻率的高低和再生類型存在顯著差異。何勇等[38]用6個高羊茅(Festucaelata)品種成熟種子為外植體進(jìn)行了愈傷組織誘導(dǎo)，發(fā)現(xiàn)不同品種在相同培養(yǎng)條件下，愈傷組織誘導(dǎo)差異十分顯著，而分化再生能力無明顯差異。

1.2外植體的種類 外植體可以取自于植物的各種器官、組織或細(xì)胞等。外植體的種類、本身的生理生化特性對愈傷組織和不定芽的誘導(dǎo)起著決定作用。不同種類的外植體誘導(dǎo)愈傷組織和不定芽的能力大不相同；即使是同一植株，若生長在不同的環(huán)境條件(光照強度、光照時間、濕度、溫度和營養(yǎng)物質(zhì)等)下，生理生化特征也會不盡相同；不同部位的外植體在組織培養(yǎng)時對培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件的要求會不同，愈傷組織與不定芽的誘導(dǎo)能力也存在差異。這些差異可能是外植體本身含有的內(nèi)源細(xì)胞分裂素與生長素的絕對含量和相對比例不同所造成的[39]，在植物組織培養(yǎng)過程中選擇合適的外植體至關(guān)重要。有研究表明，紅掌(Anthuriumandraeanum)不同部位的外植體(葉柄、莖段、葉)誘導(dǎo)愈傷組織的能力差異顯著。在最佳誘導(dǎo)培養(yǎng)基上，葉柄誘導(dǎo)率最高，達(dá)到86.7%，莖段次之，葉的誘導(dǎo)能力最差，但是葉最早誘導(dǎo)出愈傷組織[40]。王強龍等[41]以紫花苜蓿(Medicagosativa)的下胚軸、子葉、葉片和葉柄為外植體進(jìn)行愈傷組織誘導(dǎo)和植株再生，結(jié)果表明，葉片胚性愈傷形成率最低，葉柄和子葉比較接近，而下胚軸的胚性愈傷形成率最高，即下胚軸為最佳外植體。陳季琴等[42]對多年生黑麥草(Loliumperenne)的3個品種選取成熟種子、成熟胚、胚軸和胚根4種外植體進(jìn)行愈傷組織的誘導(dǎo)，分別得出適應(yīng)不同外植體的激素配比。

1.3培養(yǎng)基 培養(yǎng)基是維持植物組織活力和提供其生長的人工配制的營養(yǎng)物質(zhì)，在植物組織培養(yǎng)過程中，外植體的生長、分化需要的各種營養(yǎng)成分都是從培養(yǎng)基中獲得的，因此，培養(yǎng)基中營養(yǎng)物質(zhì)的成分和比例對愈傷組織的誘導(dǎo)和植株再生起著決定性的作用。選擇合適的培養(yǎng)基是植物組織培養(yǎng)成功的關(guān)鍵，培養(yǎng)基的選擇主要考慮兩個方面：基本培養(yǎng)基的種類和各種激素的濃度及比例。植物組織培養(yǎng)中常用的基本培養(yǎng)基有MS和B5兩種，MS適合于大多數(shù)的雙子葉植物，而B5培養(yǎng)基常用于單子葉植物的組織培養(yǎng)。組織培養(yǎng)過程中，要根據(jù)植物的種類和外植體的類型選擇合適的培養(yǎng)基，這樣才能得到較好的誘導(dǎo)和再生效果。馮波[43]分別在基本培養(yǎng)基MS和B5上對霸王(Zygophyllumxanthoxylum)子葉、莖和莖節(jié)進(jìn)行愈傷組織誘導(dǎo)，結(jié)果表明，MS更適合作為霸王組織培養(yǎng)的基本培養(yǎng)基。誘導(dǎo)蒜(Alliumsativum)的不定芽生根時，1/2 B5培養(yǎng)基的效果最好[44]。

1.4植物生長調(diào)節(jié)劑的種類及濃度配比 植物生長調(diào)節(jié)劑在組織培養(yǎng)的過程中有著重要的作用。植物內(nèi)源激素是影響組織培養(yǎng)過程中形態(tài)發(fā)生變化的內(nèi)在因素，不同基因型的外植體間內(nèi)源激素的差異對愈傷組織和芽的誘導(dǎo)有重要的影響，植物生長調(diào)節(jié)劑則是通過調(diào)整植物內(nèi)源激素的水平而起作用。生長調(diào)節(jié)劑的種類和濃度配比都會對植物組織培養(yǎng)造成影響。有研究表明[45]，在培養(yǎng)基中加入2,4-D時，黑麥草成熟種子20 d后出現(xiàn)淡黃色的愈傷組織，無2,4-D的培養(yǎng)基不能誘導(dǎo)產(chǎn)生胚性愈傷組織；當(dāng)2,4-D質(zhì)量濃度為0～5 mg/L時，隨著2,4-D質(zhì)量濃度增加，黑麥草愈傷組織的誘導(dǎo)率逐漸增加。楊茹等[46]的研究表明，黑麥草成熟種子添加2,4-D的愈傷組織誘導(dǎo)率顯著高于添加NAA的，且2,4-D質(zhì)量濃度為7 mg/L時誘導(dǎo)率最高，愈傷組織的質(zhì)量也最好。在含有2,4-D 的培養(yǎng)基中加入少量的6-BA (0.1 mg/L)能進(jìn)一步促進(jìn)愈傷組織的誘導(dǎo)，隨著6-BA質(zhì)量濃度的升高，愈傷組織的誘導(dǎo)率反而下降，濃度越高抑制作用越顯著。胡張華等[47]在N6+9 mg/L 2,4-D上添加2.0 mg/L ABA，發(fā)現(xiàn)高羊茅成熟種子的愈傷組織誘導(dǎo)率明顯提高，且能有效抑制胚芽和根的形成。

1.5培養(yǎng)條件 植物組織培養(yǎng)的培養(yǎng)條件主要包括光照強度和時間、溫度及相對濕度。由于植物材料培養(yǎng)在含糖的培養(yǎng)基中，光照的主要作用是誘導(dǎo)植物組織的形態(tài)建成，光照強度影響著離體培養(yǎng)細(xì)胞的增殖和器官的分化，對外植體細(xì)胞最初分裂的影響更為顯著。在以桃葉衛(wèi)矛(Euonymusbungeanus)的硬枝為外植體誘導(dǎo)叢生芽的培養(yǎng)中，當(dāng)光照強度為18 μmol/(m2·s)時，未能誘導(dǎo)出叢生芽并且硬枝逐漸變黃死亡；光照強度為36 μmol/(m2·s)時，才能誘導(dǎo)出叢生芽[48]。光照時間也會影響愈傷組織和芽的誘導(dǎo)，在培養(yǎng)甘薯(Ipomoeabatatas)莖尖分生組織時，光照時間14 h/d要優(yōu)于10 h/d[49]。溫度對愈傷組織的誘導(dǎo)和生長有著決定作用，有研究表明[50]，溫度對草珊瑚(Sarcandraglabra)愈傷組織的誘導(dǎo)和生長影響顯著，溫度在23～28 ℃時，愈傷組織誘導(dǎo)率高且生長快，當(dāng)溫度在15 ℃左右或32 ℃以上時，愈傷組織的生長受到嚴(yán)重抑制，逐漸死亡。同時變溫也傷害草珊瑚的愈傷組織，影響其生長。相對濕度是影響試管苗或其他離體器官在培養(yǎng)容器內(nèi)水分狀況的重要環(huán)境因素之一[51]。尹品訓(xùn)等[52]研究表明，激素水平、溫度、光照都不是大麻(Cannabissativa)玻璃化苗產(chǎn)生的主要影響因素，而濕度則是其產(chǎn)生的關(guān)鍵因素。

1.6其他因素 提供外植體植株的年齡也是影響愈傷組織誘導(dǎo)和分化的一個重要因素，有研究表明[53]，以低齡的幼苗下胚軸作外植體時，甘藍(lán)型油菜(Brassicanapus)芽的分化率最高，生長5 d的甘藍(lán)型油菜下胚軸再生頻率為35.0%，而當(dāng)苗齡為9 d時，再生頻率只有20.2%。趙軍良等[54]研究發(fā)現(xiàn)，3～4 d的白菜(B.pekinensis)無菌苗的子葉分化率顯著高于其他苗齡。植物的組織培養(yǎng)過程中常常會產(chǎn)生大量的乙烯(C2H4)，外植體在培養(yǎng)過程中生長素的運輸會因為乙烯的存在而受到抑制，這導(dǎo)致器官和體細(xì)胞胚的發(fā)生受到影響。通常誘導(dǎo)愈傷組織和不定芽時，在培養(yǎng)基中加入乙烯抑制劑(如硝酸銀、氯化鈷、AVG、水楊酸等)，不定根的誘導(dǎo)會顯著地受到抑制，同時愈傷組織能快速形成，加快器官和體細(xì)胞胚的發(fā)生，外植體產(chǎn)生不定芽的數(shù)目也會增加，更為重要的是能促進(jìn)某些很難再生的物種產(chǎn)生不定芽，從而提高再生頻率[55]。很多研究都表明，AgNO3對大白菜、油菜等植物的組織培養(yǎng)與植株再生有不同程度的促進(jìn)作用[56]。AgNO3對愈傷組織和不定芽誘導(dǎo)的促進(jìn)作用不是因為能夠抑制乙烯的合成，而是阻止了乙烯對多胺合成的干擾，多胺的合成則可以促進(jìn)外植體體細(xì)胞胚的發(fā)生和不定芽的分化。另外AgNO3也會抑制乙烯的積累，降低培養(yǎng)容器中乙烯的濃度，從而促進(jìn)不定芽的分化。在植物組織培養(yǎng)過程中培養(yǎng)基多為固體培養(yǎng)基，需要加入固化劑。一般使用瓊脂，瓊脂品質(zhì)的好壞也會影響愈傷組織與芽的誘導(dǎo)分化。為了達(dá)到較好的離體培養(yǎng)效果，應(yīng)該選擇雜質(zhì)少、純度高、凝膠透亮、凝固快的瓊脂。

2 植物組織培養(yǎng)中存在的主要問題及解決方法

在植物組織培養(yǎng)的過程中，常常會存在褐化、污染和玻璃化等現(xiàn)象，這些問題嚴(yán)重影響組織培養(yǎng)的效果，應(yīng)盡量避免其發(fā)生。

2.1褐化及控制措施 褐化，也稱酚污染，是指外植體在組織培養(yǎng)過程中，自身組織中酚類化合物與空氣接觸發(fā)生氧化反應(yīng)產(chǎn)生棕褐色的酮類物質(zhì)，使外植體變褐并逐漸死亡的現(xiàn)象。褐化中產(chǎn)生的有毒物質(zhì)不僅使外植體和培養(yǎng)基變色，而且抑制很多酶的活性，嚴(yán)重影響外植體愈傷組織的誘導(dǎo)和脫分化，甚至?xí)斐善渌劳?。褐化現(xiàn)象的發(fā)生與否是由外植體組織中所含的酚類化合物多少和多酚氧化酶活性決定的。因此，影響褐化的因素主要為外植體材料和酶促因子[57]。有研究表明，抗氧化劑聚乙烯基吡咯烷酮(PVP)及抗壞血酸(Vc)濃度為200 mg/L時，可延遲野牛草(Buchloedactyloides)成熟胚愈傷組織的褐化；縮短繼代周期至5 d可有效防止愈傷組織褐化；外源多胺能影響內(nèi)源多胺與乙烯的合成，并可減輕愈傷組織的褐化，改善其質(zhì)量[58]。無花果(Ficuscarica)組織培養(yǎng)中，剛長出幼葉的頂芽與未發(fā)芽的頂芽相比，褐化現(xiàn)象較嚴(yán)重，分化率也較低[59]。王文靜等[60]在鳶尾(Iristectorum)組織培養(yǎng)的培養(yǎng)基中加入0.1% Vc或0.3%活性炭能明顯防止褐化。劉聞川等[61]探討了黑暗和1 000、2 000、3 000 lx的不同光照條件對槲蕨(Drynariaroosii)組織培養(yǎng)外植體褐化的影響，結(jié)果表明，在1 000 lx光照處理下槲蕨外植體的總酚含量積累較少。

在組織培養(yǎng)中可采用以下方法來避免或減輕褐化：1)培養(yǎng)基中加入抗氧化劑(如Vc、檸檬酸、二硫蘇糖醇等)或在抗氧化液中對外植體進(jìn)行切割、剝離等處理。2)經(jīng)常繼代可以防止酮類物質(zhì)在培養(yǎng)基中的積累，減輕其對外植體的傷害，降低褐化發(fā)生的概率。3)培養(yǎng)基中加入1%的活性炭，由于其吸附作用可以除去酚類氧化產(chǎn)物，減少有毒物質(zhì)對外植體的毒害；活性炭還可以減少光照強度，進(jìn)一步降低褐化發(fā)生的可能；但活性炭也會吸附培養(yǎng)基中的營養(yǎng)物質(zhì)和外源激素，所以含量不能過多。4)光照可以誘導(dǎo)植物組織內(nèi)有些酚類氧化酶的活性，因此，組織培養(yǎng)的最初階段在黑暗條件下進(jìn)行會減少褐化的發(fā)生。

2.2污染及解決措施 植物組織培養(yǎng)的過程較長，培養(yǎng)基中營養(yǎng)物質(zhì)充足，光照、溫度、濕度和pH值等培養(yǎng)條件也適合大多數(shù)微生物的生長，并且微生物生長迅速、繁殖周期短，所以組織培養(yǎng)中任何一步帶菌都會污染整個體系。一般造成污染的原因有兩種：1)外植體本身寄生了很多微生物；2)實驗環(huán)境和操作過程中病原侵入到培養(yǎng)基中而造成污染。引起污染的微生物主要有細(xì)菌、霉菌和酵母菌三類，后兩類生長較快、造成的污染很容易發(fā)現(xiàn)并及時處理；但是細(xì)菌在培養(yǎng)基中有潛伏期，造成的污染一般不容易覺察，因此，細(xì)菌造成的污染在植物組織培養(yǎng)中是最嚴(yán)重的。污染不僅影響外植體的正常生長，更破壞了組織培養(yǎng)的正常進(jìn)行，造成時間和資源的浪費。因此，在植物組織培養(yǎng)過程中，應(yīng)該嚴(yán)格控制污染：對外植體進(jìn)行嚴(yán)格的消毒，一般在75%的酒精、5%的次氯酸鈉或1%的HgCl2溶液中漂洗，在不損害外植體生長活力的情況下將其自帶的病原降到最少[62]；保持操作環(huán)境的清潔，操作中應(yīng)穿戴橡膠手套、口罩、帽子，減少甚至消除環(huán)境和操作過程中的污染。

2.3玻璃化現(xiàn)象及其消除對策 玻璃化(vitrification)也稱過度水化現(xiàn)象，是指植物組織培養(yǎng)過程中外植體因生理失調(diào)或生理病變而呈半透明狀、外觀形態(tài)異常的現(xiàn)象。由于玻璃化苗的生理功能異常，難以移栽成活，玻璃化苗的出現(xiàn)對植物快速微繁殖是不利的。在木本及草本植物中已報道出現(xiàn)玻璃化苗的植物達(dá)70多種[63]。玻璃化苗的組織或植株呈半透明、水漬狀，脆弱易碎[64]；葉綠素和蛋白質(zhì)含量顯著下降，分化能力降低，很難繼續(xù)增殖和生根[65]。目前，研究已證實玻璃化現(xiàn)象只是植株的一種表型特征，玻璃化的組織器官在一定條件下可恢復(fù)，并不會遺傳到后代[66]。

防止玻璃化的方法主要有：1)基本培養(yǎng)基選擇固體培養(yǎng)基，并適當(dāng)提高培養(yǎng)基中瓊脂的濃度，降低培養(yǎng)基的襯質(zhì)勢，阻止細(xì)胞過多的吸水，從而防止玻璃化現(xiàn)象的發(fā)生；2)增加培養(yǎng)基中蔗糖的含量，培養(yǎng)基的滲透勢也就會隨之降低，外植體不能從培養(yǎng)基中獲得過多的水分而發(fā)生玻璃化現(xiàn)象；3)降低培養(yǎng)基中細(xì)胞分裂素的濃度；4)嚴(yán)格控制溫度；5)把外植體置于自然光照下培養(yǎng)，可消除輕微的玻璃化現(xiàn)象；6)盡可能的增加培養(yǎng)容器的通風(fēng)性，以降低相對濕度，改善氧氣供應(yīng)狀況，可選用透氣性好的封口膜封口。張燕玲等[67]在滿天星(Gypsophilasp.)組織培養(yǎng)中，發(fā)現(xiàn)玻璃化苗的數(shù)量隨著培養(yǎng)基中糖分和瓊脂濃度的增加而減少，而且聚乙烯醇對滿天星玻璃化現(xiàn)象有明顯的抑制作用。趙佐敏[68]在非洲菊(Gerberajamesonii)組培苗玻璃化控制研究中表明，隨著6-BA濃度的降低，玻璃化苗比例呈遞減趨勢；隨著溫度的降低(從28 ℃降到18 ℃)，玻璃化苗逐漸消失；使用透氣性封口膜可抑制玻璃化苗的產(chǎn)生。

3 組織培養(yǎng)在草類植物中的研究和應(yīng)用

植物組織培養(yǎng)技術(shù)在草類植物中的研究和應(yīng)用起步相對較晚，但近年來發(fā)展迅速，已被廣泛應(yīng)用于草類植物的快速繁育、遺傳轉(zhuǎn)化、細(xì)胞和分子育種以及次生代謝產(chǎn)物生產(chǎn)等諸多方面。

3.1無性系的快速繁殖 應(yīng)用組織培養(yǎng)進(jìn)行無性系的快速繁殖可追溯到20世紀(jì)60年代的“蘭花工業(yè)”[69]，直到現(xiàn)在已成為組織培養(yǎng)應(yīng)用十分普遍的一個領(lǐng)域，成千上萬種植物通過離體繁殖得到無性系，并形成產(chǎn)業(yè)，帶來了巨大的經(jīng)濟(jì)效益。草類植物的無性系繁殖主要利用了其繁殖速度快、繁殖量大、不受地區(qū)氣候影響、占用土地面積小等特點，可用于解決一些品種繁殖系數(shù)低、周期長的問題，特別對于名貴稀有草類的繁殖推廣具有重要意義(表1)。

3.1.1稀缺瀕危草類的快速繁殖 利用組織培養(yǎng)快速繁殖稀缺瀕危草類主要是對名貴中草藥的繁殖。近年來隨著對許多草類植物的化學(xué)成分及藥理方面的研究，許多草類植物的藥用價值逐漸被提出。如金鐵鎖(Psammosilenetunicoides)已作為稀有瀕危物種被列于《中國植物紅皮書》中，屬國家二級保護(hù)植物[70]。甘草(Glycyrrhizauralensis)作為醫(yī)藥中最常見的藥物，早在1984年就進(jìn)行了試管無性繁殖研究工作[71]。香根草具有特殊的生物學(xué)特征和強大的根系，在水土保持方面起著重要的作用，主要靠分蘗繁殖，遠(yuǎn)不能滿足實際需要，為提高香根草的繁殖速度，韓露等[5]對其愈傷組織誘導(dǎo)和快速繁殖進(jìn)行了研究。麻花秦艽是常用的上品藏藥，徐文華和陳桂琛[6]以其莖尖為外植體進(jìn)行了離體快速繁殖試驗?？嗥ぬ俦粐覍徟鸀橹苍葱詺⑾x劑，其乳油、水乳劑、微乳劑已不斷投放市場并收到了巨大的經(jīng)濟(jì)效益和社會效益。隨著人們對苦皮藤的大力開發(fā)利用, 自然資源已面臨短缺，為有效保護(hù)野生資源，馬艷等[7]對其組織培養(yǎng)進(jìn)行了研究，為其快速繁殖和工業(yè)化生產(chǎn)提供了有效途徑。

3.1.2優(yōu)良品系的無害化快速繁殖 在自然界中，許多草類植物的種子不易獲得或存在發(fā)芽率很低的問題，因此采用根系無性繁殖。但根系長期的無性繁殖易感染病毒，導(dǎo)致種群退化，產(chǎn)量下降，品質(zhì)低劣。用南丹參優(yōu)良株系的莖尖或幼葉進(jìn)行組織培養(yǎng)快速繁殖，1株良種苗1年可繁殖上萬株試管苗，可迅速擴大優(yōu)良種群[8]。溪黃草是民間常用草藥，用種子繁殖后代，性狀容易分離；扦插繁殖生根困難而且繁殖系數(shù)低，所以導(dǎo)致其很難推廣；利用組織培養(yǎng)技術(shù)進(jìn)行無性繁殖既可以保持其優(yōu)良種性，又可以短期內(nèi)大量繁殖，使工廠化育苗成為可能[9]。黃芩不僅是一種草本藥用植物，國內(nèi)還被作為盆景進(jìn)行栽培，但利用種子和扦插繁殖容易感染病毒，導(dǎo)致品種退化；為滿足市場要求，培育優(yōu)良種苗，李永紅等[10]進(jìn)行了黃芩的組織培養(yǎng)與快速繁殖研究。

表1 組織培養(yǎng)在草類植物上應(yīng)用的成功舉例

3.1.3轉(zhuǎn)基因植株的快速繁殖 隨著現(xiàn)代分子生物學(xué)的快速發(fā)展，運用傳統(tǒng)雜交育種和基因工程相結(jié)合培育草類新品種已成為育種的重要手段。目前，轉(zhuǎn)基因高羊茅、紫羊茅、黑麥草和早熟禾等禾本科草類植物和豆科牧草苜蓿、白三葉等已培育成功，但考慮到轉(zhuǎn)基因植株的遺傳穩(wěn)定性，對轉(zhuǎn)基因植株的大量擴繁多采用無性繁殖的方法，例如，包愛科[11]對AVP1轉(zhuǎn)基因紫花苜?？鼓嫘詸z測時，使用莖段扦插的方法進(jìn)行快速擴繁；但轉(zhuǎn)基因草類植物如單子葉的禾本科草類，不能使用扦插的方法，利用組織培養(yǎng)技術(shù)可以加快其快速繁殖。

3.2草類植物遺傳轉(zhuǎn)化再生體系的建立 遺傳轉(zhuǎn)化系統(tǒng)是指將外源基因通過某種方法導(dǎo)入植物細(xì)胞或原生質(zhì)體，利用細(xì)胞的全能性獲得轉(zhuǎn)基因植株，從而有目的地改變植物的某些性狀。所以，建立組織培養(yǎng)再生體系是遺傳轉(zhuǎn)化的前提，只有良好的再生體系才可以提高轉(zhuǎn)基因的效率。目前為止，對草類植物進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化的再生體系主要通過愈傷組織、懸浮細(xì)胞和原生質(zhì)體培養(yǎng)建立的(表2)。

3.2.1愈傷組織為受體的遺傳轉(zhuǎn)化 在草類植物中，以愈傷組織為受體已建立了許多轉(zhuǎn)基因體系。金淑梅等[12]用根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)法，以愈傷組織為受體，將目的基因Gus整合進(jìn)苜?；蚪M中。劉萍等[13]以草坪型黑麥草愈傷組織為受體獲得轉(zhuǎn)基因株系Gsc_LP5。馬生健等[14]用高羊茅種胚離體誘導(dǎo)的胚性愈傷組織作受體進(jìn)行了基因槍轟擊試驗，獲得了遺傳穩(wěn)定的抗除草劑PPT的轉(zhuǎn)化植株。趙軍勝等[15]用高羊茅下胚軸來源的胚性愈傷組織進(jìn)行了遺傳轉(zhuǎn)化。采用下胚軸為外植體，已成功地將擬南芥(Arabidopsisthaliana)AtNHX1[16]和AVP1[17]基因轉(zhuǎn)化紫花苜蓿，獲得了耐鹽、耐旱和耐貧瘠性顯著提高的紫花苜蓿新品系。

3.2.2懸浮細(xì)胞為受體的遺傳轉(zhuǎn)化 最初利用組織培養(yǎng)進(jìn)行的遺傳轉(zhuǎn)化，以懸浮細(xì)胞為受體比較常見。Wang等[18]以懸浮細(xì)胞系為受體，獲得了轉(zhuǎn)Hpt和Bar基因的高羊茅。Spangenberg等[19]用高羊茅胚性懸浮系為受體進(jìn)行了遺傳轉(zhuǎn)化。Dalton等[20]通過基因槍轟擊懸浮細(xì)胞系，建立了黑麥草的轉(zhuǎn)基因體系；使用硅碳纖維介導(dǎo)了黑麥草、高羊茅、匍匐剪股潁的細(xì)胞懸浮系，獲得了抗潮霉素的轉(zhuǎn)基因植株[21]。Bettany等[22]用高羊茅和黑麥草胚性懸浮細(xì)胞為受體，使用農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)導(dǎo)法導(dǎo)入了外源基因Gus。胡張華等[23]用帶有質(zhì)粒pDBA121(含Hpt基因和Bar基因)的農(nóng)桿菌菌株EHA105轉(zhuǎn)化高羊茅胚性懸浮細(xì)胞，建立了可重復(fù)的、高效的農(nóng)桿菌介導(dǎo)的高羊茅遺傳轉(zhuǎn)化系統(tǒng)。

表2 草類植物以組織培養(yǎng)為手段進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化的舉例

3.2.3原生質(zhì)體為受體的遺傳轉(zhuǎn)化 由于從懸浮細(xì)胞培養(yǎng)獲得的植株在遺傳上存在不穩(wěn)定的現(xiàn)象，同時也不便于進(jìn)行轉(zhuǎn)基因工作[74]。Ha等[24]用電激法以高羊茅原生質(zhì)體為受體進(jìn)行了遺傳轉(zhuǎn)化。Wang等[25]以原生質(zhì)體為受體，獲得了轉(zhuǎn)Hpt基因的黑麥草。Inokuma等[26]以原生質(zhì)體為受體獲得了轉(zhuǎn)Gus和Hpt基因的日本結(jié)縷草。Chai等[27]以原生質(zhì)體為受體成功的將Hpt基因?qū)胭橘爰艄煞f。

3.3花藥培養(yǎng)和單倍體育種 花藥組織培養(yǎng)主要是誘導(dǎo)形成單倍體植株，可以快速獲得純系，縮短育種時間。自Guha和Mahcshwari首次從曼陀羅(Daturastramonium)花藥誘導(dǎo)出花粉單倍體植株以來，世界各地均開展了花藥培養(yǎng)，我國于20世紀(jì)70年代獲得了第一批水稻(Oryzasativa)花藥培養(yǎng)的單倍體植株。目前利用花藥培養(yǎng)培育的新品種多見于農(nóng)作物，如水稻、小麥、玉米(Zeamays)等。近年來，先后也出現(xiàn)了草類植物的花藥培養(yǎng)，如馬菊蘭[28]對4個苜蓿品種的花藥培養(yǎng)預(yù)處理方法和培養(yǎng)基進(jìn)行了研究，從而建立了苜?；ㄋ幣囵B(yǎng)高效再生體系，大大提高了苜蓿育種的效率；耿小麗[29]以5個苜蓿品種為試材，利用花藥培養(yǎng)誘導(dǎo)了苜蓿單倍體植株；段承俐等[30]開展了三七的花藥培養(yǎng)，吳中心等[31]利用花藥培養(yǎng)系統(tǒng)選育了煙草抗赤星病品系(表1)。

3.4植物體細(xì)胞誘變和突變體篩選 植物體細(xì)胞在離體培養(yǎng)條件下本身容易發(fā)生染色體畸變和基因突變，如果采用改變外界條件進(jìn)行誘變，則誘變的幾率更高。這為培育新品種奠定了良好的基礎(chǔ)。周榮仁等[75]用組織培養(yǎng)及逐步增加NaCl濃度的方法篩選出能耐2% NaCl的煙草愈傷組織，但在2% NaCl培養(yǎng)基中繼代29次后，再移入無鹽培養(yǎng)基中培養(yǎng)11和20代后，耐鹽性退化到只耐1.5%與1.0% NaCl的水平，不能保持提高了的耐鹽性。李紅等[74]以紫花苜蓿莖段為材料進(jìn)行愈傷組織誘導(dǎo)，采用紫外線和NaN3化學(xué)誘變處理其愈傷組織，提高了紫花苜蓿的抗堿性。李波等[75]對紫花苜蓿莖段誘導(dǎo)的愈傷組織進(jìn)行不同濃度的硫酸二乙酯(DES)誘變處理，在-7 ℃低溫下進(jìn)行篩選，獲得了抗寒性突變體(表1)。

3.5次生代謝產(chǎn)物生產(chǎn) 植物中含有數(shù)量極為可觀的次生代謝物質(zhì)，目前發(fā)現(xiàn)的植物天然代謝產(chǎn)物已超過2萬種，而且還以每年新發(fā)現(xiàn)1 600余種的速度遞增[76]。早在1979年，我國學(xué)者就提到離體培養(yǎng)的植物組織中可能產(chǎn)生一些物質(zhì)，尤其是有經(jīng)濟(jì)價值的藥物[77]。例如，中藥草金鐵鎖根部富含皂甙，對一些炎癥和致病性細(xì)菌和真菌都有抑制作用，丹參根部含有丹參酮ⅡA、隱丹參酮等脂溶性萜醌類化合物，是我國的傳統(tǒng)中藥，具有活血祛瘀、通經(jīng)止痛、清心除煩、養(yǎng)血安神之功效。近年來，次生代謝物質(zhì)被人類廣泛應(yīng)用，不僅制成藥品，還有食品添加劑、風(fēng)味物質(zhì)、香料、色素、化妝品、生物殺蟲劑和農(nóng)業(yè)化肥等[78]。但由于諸多原因，依靠野生和栽培植物已經(jīng)遠(yuǎn)遠(yuǎn)不能滿足日益增長的市場需求。植物組織培養(yǎng)就成為解決這個問題行之有效的方法。紫草系多年生植物，其根部富含紫草寧，Yazaki等[32]研究了在紫草懸浮液中光對紫草寧合成的影響。鄭光植等[33]還開展了三七、人參和西洋參這3種藥用植物的細(xì)胞培養(yǎng)，比較了它們愈傷組織培養(yǎng)及細(xì)胞懸浮培養(yǎng)中抗癌皂苷Rh1的含量，以期實現(xiàn)其次生代謝物的工業(yè)生產(chǎn)。在日本，用培養(yǎng)的人參懸浮細(xì)胞生產(chǎn)人參皂苷已形成規(guī)模。珍貴中藥植物高山紅景天的根和根莖中含有以紅景天甙為主的次生代謝物質(zhì)，吳雙秀[34]用植物組織和細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)，對愈傷組織的狀態(tài)進(jìn)行調(diào)控，得到紅景天甙含量高、生長速度快、初步分化的愈傷組織顆粒(表1)。

4 結(jié)束語

植物組織培養(yǎng)經(jīng)過一個多世紀(jì)的發(fā)展，技術(shù)方法已經(jīng)相當(dāng)完善。目前組織培養(yǎng)技術(shù)大規(guī)模應(yīng)用于具有重要經(jīng)濟(jì)價值的農(nóng)作物、花卉、果木中，而且也開始應(yīng)用于草類植物中。但要全面推進(jìn)組培苗的產(chǎn)業(yè)化，還存在一些問題，如生產(chǎn)成本較高；有些植物繁殖系數(shù)偏低；技術(shù)流程繁瑣等。今后還需要繼續(xù)加強植物組織培養(yǎng)方面的研究和探索，全面徹底解決組織培養(yǎng)過程中出現(xiàn)的問題，使組織培養(yǎng)這一生物技術(shù)更好地服務(wù)于科學(xué)研究和生產(chǎn)實踐。

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