王 爽,張鈺泉，張 幸，李風(fēng)華

(上海中醫(yī)藥大學(xué) 科學(xué)技術(shù)實(shí)驗(yàn)中心,上海 201203)

黃芪湯顆粒劑由黃芪、生甘草等中藥組成，具有補(bǔ)氣生津的功效，能不同程度的干預(yù)大鼠膽汁瘀積性肝硬化形成[1]。黃芪是黃芪湯顆粒劑的君藥，為豆科植物蒙古黃芪Astragalusmembranaceus(Fisch)Beg.var.mongholicus(Beg.)Hisao或膜莢黃芪Astragalusmembranaceus(Fisch)Beg.var.mongholicus(Beg.)的干燥根。藥理研究表明黃芪具有心肌保護(hù)[2]、降血糖[3]、抗肝纖維化[4]等作用。黃芪甲苷(astragaloside IV)是黃芪中的主要化學(xué)有效成分，因此，選擇測(cè)定黃芪甲苷(astragaloside IV)的含量來(lái)評(píng)價(jià)黃芪湯顆粒劑的質(zhì)量。目前，黃芪甲苷的含量測(cè)定方法主要有熒光分光光度法[5]、薄層掃描法[6-7]、柱前衍生高效液相色譜法[8]、HPLC-MS/MS法[9-10]等。因?yàn)闊晒夥ㄒ髽悠芳兌雀?，薄層掃描法重現(xiàn)性差，高效液相色譜法在紫外區(qū)僅有末端吸收且干擾較多，衍生化高效液相色譜法處理樣品過(guò)程復(fù)雜，質(zhì)譜法專一性較強(qiáng)，但成本過(guò)高。本實(shí)驗(yàn)采用HPLC-ELSD法，靈敏度高，重現(xiàn)性好，用于沒(méi)有紫外吸收的黃芪甲苷的含量測(cè)定，結(jié)果滿意。

1 儀器與試樣

Agilent 1100液相色譜儀(美國(guó)Agilent公司)，Varian 380-LC型蒸發(fā)光散射檢測(cè)器(美國(guó)Varian公司)，Agilent 1100化學(xué)工作站。

黃芪甲苷對(duì)照品(購(gòu)自中國(guó)藥品生物制品檢定所，批號(hào):110781-200613)，甲醇(色譜純，Merck公司，批號(hào)I568307048),正丁醇(分析醇，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，批號(hào)T20100305),氨水(分析純，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，批號(hào)T20090902)，水為重蒸水(自制)，黃芪湯顆粒劑(自制)。

2 色譜條件

色譜柱：Thermo Hypersil-Keystone ODS(250 mm×4.6 mm,5 μm)；流動(dòng)相:甲醇-水(65∶35)；流速：1.0 mL/min；柱溫：50 ℃；進(jìn)樣量：20 μL；氮?dú)廨敵鰤毫?.5 MPa；ELSD參數(shù)：Evap 90 ℃,Neb 50 ℃,Gas 1.6 mL/min。

3 溶液的制備

3.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液的制備 精密稱取黃芪甲苷對(duì)照品13 mg，置10mL量瓶中，加甲醇稀釋至刻度。

3.2 供試品溶液的制備 精密稱取黃芪湯顆粒劑2.5 g,加甲醇20 mL，超聲提取30 min，抽濾，濾液水浴揮干，加水20 mL,用水飽和的正丁醇萃取4次，每次40 mL，合并正丁醇層，用氨試液洗2次，每次40 mL，合并正丁醇層，水浴揮干，加甲醇定容于5 mL量瓶中，置4 ℃冰箱，備用。

4 方法學(xué)驗(yàn)證

4.1 線性關(guān)系考察 將黃芪甲苷標(biāo)準(zhǔn)溶液依次稀釋成濃度為1 000、800、400、200、100 μg/mL的溶液。分別各進(jìn)樣20 μL，測(cè)定黃芪甲苷峰面積色譜圖(見(jiàn)圖1)。以峰面積A的常用對(duì)數(shù)值為縱坐標(biāo)，以各進(jìn)樣濃度C的常用對(duì)數(shù)值為橫坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸。回歸方程為：LogA=1.428 8 LogC+0.219 6，r=0.999 8(n=5)。黃芪甲苷在2～20 μg范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

4.2 精密度試驗(yàn) 取濃度為800 μg/mL的黃芪甲苷標(biāo)準(zhǔn)品溶液，重復(fù)進(jìn)樣6次，測(cè)定相應(yīng)的峰面積，計(jì)算黃芪甲苷峰面積的RSD為0.82%。

圖1 對(duì)照品溶液的HPLC色譜圖

圖2 供試品溶液的HPLC色譜圖

4.3 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取同一分供試品溶液,分別在0、1、2、3、4、5 h進(jìn)樣測(cè)定相應(yīng)的峰面積，計(jì)算黃芪甲苷峰面積的RSD為2.05%。

4.4 重現(xiàn)性試驗(yàn) 精密稱取5分黃芪湯顆粒劑0.5 g，處理方法同3.2，分別進(jìn)樣測(cè)定各分供試品溶液中黃芪甲苷的峰面積，計(jì)算RSD為4.12%。

4.5 回收率試驗(yàn) 精密稱取已測(cè)知含量的黃芪湯顆粒劑共6分，各精密加入黃芪甲苷對(duì)照品適量。按3.2方法處理，進(jìn)樣測(cè)定各分樣品中黃芪甲苷的含量，計(jì)算回收率，結(jié)果測(cè)得平均回收率為101.65%，RSD為2.32%，見(jiàn)表1。

表1 樣品中黃芪甲苷的回收率試驗(yàn)結(jié)果

5 樣品含量測(cè)定

精密稱取2個(gè)批號(hào)的供試品,按3.2方法處理，分別取20 μL注入液相色譜儀中，測(cè)定黃芪甲苷的峰面積，將峰面積取常用對(duì)數(shù)后代入線性方程進(jìn)行計(jì)算,求出供試品的含量。2個(gè)批號(hào)的樣品含量測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 樣品含量測(cè)定結(jié)果

6 討論

本文用3種方法處理樣品，第1種方法直接用水超聲處理30 min，用正丁醇萃取4次，每次40 mL,合并正丁醇層，用氨試液洗2次，每次40 mL，合并正丁醇層，揮干，用甲醇定容于5 mL量瓶中。第2種方法先加甲醇超聲處理30 min，水浴揮干，加適量水，再按第1種方法操作。第3種方法是在第2種方法的基礎(chǔ)上，用D101大孔樹(shù)脂處理。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),第1種方法不能將中藥復(fù)方中黃芪甲苷提取完全，第2種方法可將中藥復(fù)方顆粒劑中的黃芪甲苷提取充分，第3種方法經(jīng)D101大孔樹(shù)脂處理后,樣品中雜質(zhì)干擾少一些，但黃芪甲苷損失較多。第2種方法雖然有雜質(zhì)干擾，但樣品處理過(guò)程較簡(jiǎn)單，不影響黃芪甲苷含量測(cè)定的準(zhǔn)確性。因此，樣品處理時(shí)采用第2種方法。在穩(wěn)定性試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn),樣品放置室溫時(shí)間過(guò)長(zhǎng)時(shí)黃芪甲苷色譜峰面積有少量升高現(xiàn)象,所以應(yīng)在樣品處理后盡早測(cè)定。本實(shí)驗(yàn)建立的HPLC-ELSD方法準(zhǔn)確、可靠,能滿足樣品中黃芪甲苷含量測(cè)定的要求。

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